组氨酸标签蛋白分离纯化介质的合成及其应用研究

蛋白质的分离纯化是发展蛋白组学和进行蛋白质结构功能研究与应用的前提与基础。本项目拟结合氮杂大环与金属离子配合作用强及离子液体作为支载体和绿色溶剂的优点，设计、合成一类可回收再生使用的新型蛋白质分离纯化介质- - 离子液体支载的TACN和Cyclen的金属螯合物，用于组氨酸标签 (His-tag) 蛋白的分离纯化；并通过对这类新型离子液体支载的蛋白亲和载体的回收再生使用研究，提出一种快速有效的蛋白纯化介质回收再生方法。该方法不仅可以省却传统蛋白分离方法所必需的复杂前处理操作，而且只需通过离子液体与水溶液简单的液液萃取就可以高通量地直接分离细胞裂解物，实现对组氨酸标签蛋白的分离纯化。本项目利用氮杂大环对His-tag蛋白特异结合与离子液体易操作的特点，希望制备新型的His-tag蛋白纯化介质并发展出更简便有效且经济的蛋白纯化技术，有助于进一步促进蛋白组学和蛋白质工程研究的发展。

蛋白质的分离纯化是发展蛋白组学和进行蛋白质结构功能研究与应用的前提和基础。本课题结合固定化金属螯合亲和层析法和功能化离子液体（AIL）（一种金属离子配合作用较强的氮杂大环（TACN），并将这种对组氨酸残基有特异亲和性的配体链接到两种离子液体（双环型离子液体和咪唑型离子液体）上，螯合不同金属离子（Cu2+、Ni2+、Zn2+）对组氨酸标签蛋白进行特异性液液萃取亲和纯化。实验结果表明：此纯化体系具有生物相容性，AIL/Cu2+纯化体系具有较好的亲和能力（具有80%的纯化效率），但是特异性吸附相对于另外两种金属较差（纯度仅为50%）；AIL/Zn2+纯化体系具有较好的特异性吸附能力（纯度90%）；大肠杆菌表达的组氨酸标签的绿色荧光蛋白（His-tag EGFP）经AIL/Cu2+-AIL/Zn2+体系窜联纯化得到纯度大于90%的目的蛋白；大肠杆菌中表达的组氨酸标签的青霉素结合蛋白细菌裂解液不经前处理直接用此纯化体系进行纯化，得到纯度高达95%的目的蛋白；AIL/M2+纯化介质经乙二胺四乙酸反复解吸金属离子，再重新螯合，可以回收重复利用于组氨酸蛋白的分离纯化。本研究为高通量的蛋白快速纯化提供了一新的思路和方法。