家蝇几丁质降解酶家族基因的表达特性及功能研究

Insect chitinases play vital roles during molting and metamorphosis. They are one of the important targets in the study of insect development and pest control. Housefly, common name of the fly Musca domestica, found in most parts of the world，does not bite living animals but is dangerous because it carries viral, bacteria , parasites that cause many serious disease, e.g., typhoid fever, cholera, infantile diarrhea and ameba dysentery . The current control of Musca domestica depends mainly on chemical pesticides, but drug resistance is a serious phenom-enon. This study intends to Musca domestica as the research object, to study the expression characteristics of the chitinase family genes. Looking for the enzyme target molecules which are closely related with the development and the peritrophic membrane degradation. The results will lay the theoretical foundation for the rational design and research new biological pesticide. Research contents: 1.Clons of Musca domestica chitinase family gene, analyzes the structure, function and evolution. 2. The expression characteristics of the enzyme gene at different development stages and different tissues will be analysis by real-time fluorescent quantitative PCR. Construction of prokaryotic expression vector, Preparation of polyclonal antibody. The expression characteristics of the enzyme gene will be analysis by Western blot method from protein level.3. The target gene will be Interference by using RNAi Technology, observe the change of larval phenotype, morphology (epidermis, peritrophic membrane) and the gene expression profiling, clarify and verify the function of target gene. The results will provide a scientific foundation for the development of housefly chitin-degrading enzyme family gene, and also provide the scientific basis and experimental data for further research of the harmful insects prevention.

几丁质降解酶是昆虫发育过程中蜕皮和围食膜降解的关键酶，是昆虫发育研究及探索害虫控制新策略的重要途径之一。苍蝇是一类重要的病媒昆虫，传播多种病原，还可引发过敏性疾病。目前苍蝇的抗药现象较为严重，寻求安全可靠的有害昆虫防治方法具有重要现实意义。因此，本课题拟以家蝇为研究对象，探讨其几丁质降解酶家族各基因的表达特性，寻找与虫体发育和围食膜降解密切相关的酶靶标分子，阐述其功能，为合理设计研发新型生物杀虫剂奠定理论基础。研究内容：1.克隆家蝇几丁质降解酶家族基因，进行结构、功能及进化分析。2.采用实时荧光定量PCR从基因水平分析各酶基因在虫体不同发育阶段及不同组织部位的表达特性；构建原核表达载体，制备多克隆抗体，采用western blot 方法从蛋白水平分析目的基因的表达特性。3. 采用RNAi技术干扰目的基因，观察幼虫表型、虫体组织形态（表皮、围食膜）及基因表达谱的变化，阐明和验证靶基因功能。

本研究采用生物信息学方法，从家蝇全基因组数据库中筛选获得几丁质酶家族基因序列20条，根据基因结构、蛋白质结构域、蛋白质理化特性等分析构建了系统进化树，将9个几丁质酶和11个类几丁质酶基因命名并分为9组；利用实时荧光定量PCR技术，分析了MDCht2、MDCht4、MDCht5、MDCht7、MDCht8、MDCht9、MDCht10在家蝇不同发育阶段和不同组织器官的时空表达模式；成功构建了MDCht2、MDCht9的原核表达载体，并转化到感受态细胞中诱导表达，表达产物纯化后经质谱和Westblot鉴定均表明成功获得MDCht2、MDCht9的重组蛋白；以4MU-(GlcNAc)3寡聚物为底物，测定了重组蛋白的稳定性和酶活性；采用RNA干扰（RNAi）技术，分别制备了MDCht2和MDCht9的双链RNA，通过显微注射法将dsRNA导入家蝇2龄末期幼虫体内，利用Real-time PCR技术检测MDCht2和MDCht 9基因的表达变化，检测目的基因沉默效率，统计干扰后幼虫存活率及虫体表型变化，组织形态学观察干扰后虫体体壁组织形态和几丁质含量变化；对干扰后幼虫进行了转录组测序分析研究。实验结果显示，筛选到的几丁质酶基因在家蝇生长发育的各个阶段均有不同程度的表达，其中MdCht2、MdCht5 、MdCht7和MDCht10基因在蛹期表达量最高； MdCht2、MdCht8 和MdCht9在家蝇3龄幼虫的重要组织器官（脂肪体、唾液腺、中肠、气管、马氏管和体壁）均有不同程度的表达，以体壁和唾液腺中相对表达量高；MDCht2和MDCht9重组蛋白在体外均具有几丁质酶活性， MdCht2在pH 4.0，35℃时酶活性最高；MDCht9在pH9、 45℃有较强酶活性；分别注射dsMdCht2和dsMdCht9干扰后，目的基因被有效沉默，虫体羽化时出现畸形率为5%，干扰MDCht9后幼虫存活率明显低于对照组；RNAi 后的幼虫经石蜡切片后行Calcofiuor染色，显示表皮中几丁质含量增加，提示干扰在一定程度上影响了幼虫表皮几丁质的降解，提示MDCht2和MDCht9基因可能是未来潜在的控制害虫的靶标分子。本研究从分子水平系统地分析家蝇几丁质降解酶家族基因，并重点探讨了几个几丁质酶基因的表达模式及功能。研究结果丰富了昆虫发育生物学的内容，为有害昆虫的防治提供了一定的实验依据。