一种类猪圆环病毒2型因子的病原学特性研究

P1作为从猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）病例中新发现的类猪圆环病毒2型（PCV2）因子之一，拥有目前所知的最小基因组，其核苷酸序列与PCV2的高度同源，基因组双拷贝串联分子克隆在转染的细胞胞浆和胞核中形成包涵体，对猪有较强致病性。本项目拟从蛋白水平和形态学等进一步证实P1为新发病原。.采用原核表达P1 的VP2蛋白，建立针对P1的间接ELISA抗体检测方法；构建真核表达VP2蛋白的重组质粒，免疫小鼠制备抗VP2蛋白的单抗，与通过多参数综合预测VP2 B细胞表位而合成的表位肽制备的多抗相辅用于相关研究；通过接种不同传代细胞系，利用PCR和免疫组化等技术，研究P1的细胞适应性和理化学特性，利用亲和层析纯化P1以及免疫电镜技术研究P1形态和相关特性；采用实时PCR技术和免疫组化技术研究P1在感染猪体内的分布。.该项目对于丰富病毒学理论和研究生命起源及进化具有重要意义。

采用生物信息软件和互联网服务器，分析类猪圆环病毒因子P1 VP2的二级结构和表面特性(亲水性、可塑性、可及性和抗原性)，应用多参数综合预测VP2 B细胞表位，结果确定P1 VP2蛋白肽链的6—18和80—92区段为预测的B细胞表位优势区。合成选定的抗原表位肽，与KLH 偶联，免疫家兔，制备出抗VP2多克隆抗体，免疫组化结果证明所制备的抗体可与P1蛋白反应。.利用PCR方法扩增P1 vp2基因，克隆到表达载体pET32a中，转化宿主菌BL21，经IPTG诱导，SDS—PAGE检测表达情况，纯化表达产物，Western blot鉴定，建立了针对P1的间接ELISA抗体检测方法。.将P1 的VP2蛋白基因（包括与PCV2相对应核苷酸缺失点前大片段vp2基因以及与PCV2相对应核苷酸缺失点后小片段vp2基因）分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1，免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗VP2蛋白的单抗，用建立的间接ELISA方法筛选阳性克隆；经过3次亚克隆后获得A6、D10、B8、H9共4株能够稳定传代并且分泌抗体的杂交瘤细胞株。其中A6、D10针对P1 ORF2大片段，H9、B8针对ORF2小片段。四株单克隆抗体亚类皆为IgM, 轻链均为κ链。腹水的间接ELISA效价分别是102、103、103、105 。Western-blot分析表明，四株单抗均特异地与P1 ORF2蛋白反应，而不与PCV2 ORF2蛋白反应。.将P1分子克隆转染PK15细胞获得拯救毒，连续在PK15细胞上传代，通过定量PCR技术检测病毒的增殖，结果表明P1含量可在接种细胞后96h-120h达到最高。通过免疫电镜技术和亲和层析技术，证实P1为球状病毒，无囊膜，直径约25nm；通过核酸酶消化等技术确定P1为单股、环状、负链DNA基因组。.将P1分子克隆经腹股沟淋巴结途径接种猪14天后，开始不同程度出现了病毒血症，有的猪在实验期间出现了体重减轻，皮肤苍白和腹泻等现象。接种后35天剖杀猪，可见实验组的猪大体病变包括脑充血，膀胱黏膜出血，腹股沟淋巴结出血，肺萎缩和出血。组织学变化表现为蛛网膜下腔血管充血，间质性肺炎，心肌萎缩，扁桃体滤泡组织细胞增生，胰腺细胞坏死等。利用PCR和免疫组化技术证明P1分布在感染猪的心、肝、脑、胰、性腺、肺、膀胱等组织，而对照猪则无任何症状和病理变化出现。