蛋白质翻译起始过程中起始因子的动态功能研究

The ribosome is the factory of protein biosynthesis in cell, which translates the information carried on mRNA into polypeptides. This process can be divided into four distinct steps, namely initiation, elongation, termination and ribosome recycling. The initiation phase is the most regulated and rate limiting step. In bacteria, translation initiation step is controlled by three initiation factors (IF1-3), which bind cooperatively to form the 70S initiation complex (70S IC). The structure of ICs and the mechanism of IFs in this process are still largely elusive. Through this project, we plan to investigate the function of IFs in the process of initiation step. Firstly, we construct the mutations to find the functional sites of IFs, which could be used in the following structural study. Secondly, cryo-electron microscopy (cryoEM) reconstructions of the initiation complexes could provide the detailed function of IFs. Finally, mRNA with different sequences could be used to investigate the character of different mRNAs improving our understanding of translation initiation.

生物体内蛋白质翻译过程大致可分为起始、延长、终止和再循环四个阶段。与其他三个阶段相比，翻译起始阶段需要完成mRNA、tRNA以及核糖体的组装，因而过程更加复杂，调控因素也更多，也是整个翻译过程的限速步骤。有关翻译起始过程的研究起步也相对较晚，还有许多问题仍亟待解决。本项目申请拟综合运用生物化学、结构生物学、计算生物学以及单分子生物学实验技术，对细菌翻译起始过程进行系统研究。揭示翻译起始过程不同阶段中各起始因子所发挥的功能，最终阐明该过程的分子机制，为该新型抗生素的筛选与应用提供科学依据。

核糖体将mRNA翻译成蛋白质是一个复杂的过程，这个过程可以简单地分成四个步骤：翻译起始、延伸、终止和翻译再循环。翻译的每个步骤中都需要翻译因子参与，确保蛋白质翻译的准确性和蛋白质翻译的速率，从而维正常生命活动。本项目就是以蛋白质翻译调控方面进行蛋白质翻译调控机制的研究。翻译起始因子IF2和IF3研究的比较明确，所以本项目选择IF2为研究对象进行课题的开展。IF2蛋白具有多结构域和大分子量的特点，IF2与核糖体相互作用的过程中各个亚基之间发生相对移动和GTP水解，从而促进起始tRNA与核糖体结合并与mRNA上的蛋白质翻译起始位点结合。翻译延伸的过程中我们选择特殊的翻译延伸因子lepA（又称作EF4）为研究对象，研究原核生物中的lepA和其在真核生物中的对应的翻译因子Guf1（又称作mtEF4）为研究对象进行课题的开展。通过大肠杆菌中的基因敲除和回补实验，发现lepA的缺失可以影响30S小亚基的组装。四环素存在的条件可以促进lepA在细菌内与核糖体的结合，我们把这种lepA与核糖体结合的复合物纯化出来之后，发现四环素存在条件下的70S核糖体与正常条件的不同。这类核糖体可以促进膜蛋白的翻译和稳定，从而帮助细菌应对外界的压力。Guf1存在于真核生物的线粒体中，对线粒体呼吸链复合物IV的翻译具有辅助作用。Guf1的敲除抑制细胞的增殖能力，而Guf1的过量表达可以导致线粒体核糖体翻译的停滞，从而导致线粒体翻译受到抑制。蛋白质翻译最后一步就是释放核糖体上的翻译因子与tRNA，并将70S核糖体拆分成50S大亚基与30S小亚基。RRF与EF-G就是参与这个过程的主要因子。由于这个过程发生的比较快，一般的方法难以捕捉，我们利用分子动力学模拟、单分子荧光和低温冷冻电镜技术相结合，发现在这个过程中RRF不仅自身的构想发生变化，其在核糖体上相对位置也发生改变，从而与EF-G一解离核糖体。