IS26介导肺炎克雷伯菌耐药区域结构变异机制及对适应度代价影响研究

Multiple antibiotic resistance in Klebsiella pneumoniae has emerged as an urgent threat to human health. A vast repertoire of antibiotic resistance in this species has spread via horizontal gene transfer of various mobile genetic elements (MGEs). Multi-resistance regions (MRR) containing transposons, insertion sequences and integrons usually are subject to complex reorganization. IS26 appears to have actively moulded Tn1721 and Tn3, two prevalent resistance-associated transposons in K. pneumoniae. This study will utilize genetic manipulation, counter-selection, competition assay, and bioinformatics-aid genome mining, to investigate the fitness cost of Tn1721, Tn3 and their artificial variants, the effect of IS26-mediated reorganization on fitness cost alteration of Tn1721 and Tn3 and whether SOS response plays a role in regulating the process. This study aims to elucidate whether IS26-mediated reorganization is a means of compensatory evolution to ameliorate the fitness cost of those transposons, which will advance understanding of the evolutionary trends of MRRs and the related driving force and will shed light on how alien DNA overcomes fitness cost during evolution and achieves stable inheritance. We hope this study may provide new thoughts to encounter the spread of antibiotic resistance.

肺炎克雷伯菌耐药基因多通过水平转移获得。转座子（Tn）、插入序列（IS）等构成的耐药区域常发生复杂结构变异。重要耐药元件Tn1721和Tn3变异与IS26密切相关。IS26介导耐药区域结构变异的驱动机制和生物学意义尚不清晰。外源DNA常带来生长负担，我们认为缺失变异会改善这种适应度代价。本课题基于耐药株HS11286进行Tn3/Tn1721敲除回补、多拷贝IS26片段构建、重组频率定量、竞争生长实验、基因组数据挖掘等，研究：Tn3、Tn1721缺失变异对其适应度代价的影响；多拷贝IS26介导的Tn3、Tn1721缺失变异在有选择压力和无选择压力下的频率差异，及对缺失区域是否有选择性；SOS反应机制对该过程的调控作用。阐明IS26介导的缺失变异是否是转座子克服适应度代价的补偿进化方式；探索解释耐药区域的进化规律、驱动机理及外源DNA如何克服适应度代价并稳定遗传；为控制耐药性的播散探索新思路。

肺炎克雷伯菌耐药基因多通过水平转移获得。转座子（Tn）、插入序列（IS）等构成的耐药区域常发生复杂结构变异。我们前期发现重要耐药元件Tn3和Tn1721变异均有IS26参与。本项目探究了IS26介导Tn3/Tn1721相关耐药区域结构变异的进化规律及驱动机制。我们首先开发了系列可移动遗传元件识别分析算法，通过大规模生物信息学研究，系统揭示了肺炎克雷伯菌中IS26、Tn3和Tn1721的分布特征。发现IS26广泛存在于该菌种中且在单一菌株中具有较高拷贝；在不同序列型菌株中存在数目差异，但整体与宿主菌质粒及耐药基因的获得密切相关。而肺炎克雷伯菌中的Tn3多已截断，处于退化状态，但其在因结构变异发生退化的过程中，差异性保留了功能基因，其中耐药基因较转座基因更易得到保留。进一步研究发现IS26与Tn3和Tn1721结构变异密切相关。Tn3的结构变异事件中，有34.26%与IS26相关，而IS26介导转座基因丢失是一类较为典型的变体特征。生物信息学分析和实验验证均表明IS26直接参与Tn3/Tn1721的结构变异。此外还发现IS26与其它类型可移动遗传元件In2的结构变异亦密切相关。说明IS26在肺炎克雷伯菌中是一类高度活跃的元件。另外发现，IncFIIK不相容群质粒在肺炎克雷伯菌中是IS26、Tn3和Tn1721的重要载体，其保守的接合转移模块中为该类IS26的分子播散提供遗传基础。利用实验手段，我们未能观察到Tn3和Tn1721中不同组分对适应度代价的影响存在显著差异，猜测Tn3和Tn1721中不同功能基因的选择性保留可能是特定生境中，如抗生素亚抑菌浓度下，压力选择的结果。上述结果表明肺炎克雷伯菌中看似复杂无序的耐药区域结构变异其实与宿主克隆型、可移动遗传元件类型、载体质粒型、耐药基因谱之间均存在一定规律性关联。此外，我们还利用本项目建立的方法对另一种临床常见病原菌鲍曼不动杆菌进行研究，亦观察到类似现象。我们发现鲍曼不动杆菌中一类介导多重耐药的AbaR型转座子在克隆型分布、插入位点分布、耐药基因谱、介导其结构变异的可移动遗传元件谱及自身遗传结构上存在密切关联，均与转座子骨架元件类型表现出高度相关性。提示细菌中耐药区域的复杂变异特征可能与宿主、载体等遗传背景间存在系统关联。这为探索细菌耐药区域的进化提供了新视野和新思路。