利用反应中间体橙花叔基焦磷酸结合定点突变研究倍半萜合酶环化反应起始决定因子

Sesquiterpene synthases catalyze linear universal precursor (E,E)- farnesyl diphosphate into more than 300 kinds of sesquiterpenes due to the vast stereochemical diversity of the cyclization reactions. The extensive studies on the cyclization mechanism have been well conducted and reviewed. But the controlling of the initiating cyclization is still not understood well. Our recent advance shows that that the tiny steric change of T296V mutation in Artemisia annua amorpa-4,11-diene synthase could deactivate the cyclization by inhibiting the formation of intermediate (R,E)- nerolidyl diphosphate, but a latest report shows that another key amino acid mutation Y402L in (E)-β-farnesene synthase (BFS) from Artemisia annua was sufficient to activate cyclization but mutating the corresponding site L374 in amorpha-4, 11-diene synthase (ADS) to Y could not deactivate the cyclization. Why these two paralog enzymes use different site to control the the initiating cyclization? Is it due to the totally different catalyzed mechanism of these two enzymes or the different controlling steps of these two amino acids site? This proposal is aim to unveil this important question by the aid of chemical synthetic reaction intermediate NPP and site-directed mutagenesis. Deeply understanding the mechanism of controlling of the initiating cyclization of sesquiterpene synthase will lay the foundation of enzyme rational designing for new type of compounds production.

倍半萜合酶家族催化天然底物全反式法尼基焦磷酸环化形成近300多种倍半萜烯、醇，进一步加工修饰产生种类更加繁多的衍生物。对此环化反应的特异性控制机制已经开展了非常深入广泛的研究，但是萜类合酶催化环化反应的起始控制机制还知之甚少。项目申请人团队最新的研究发现了控制紫穗槐二烯合酶环化起始反应的关键位点并阐明了其控制机理：T296V突变造成的位阻效应足以抑制倍半萜环化反应的起始步骤，导致其产物变为线性的法尼烯。但是新近报道另一个位点Y402L突变能够使黄花蒿法尼烯合酶具有生成环化产物的能力。为什么这两个旁系同源酶采取了不同的氨基酸位点来控制环化反应的起始，是这两个位点控制的关键节点不同？还是两个酶的催化机理不同？ 本项目拟利用项目申请人团队新近合成的反应中间体橙花叔基焦磷酸结合定点突变解决以上这一关键问题。详细了解倍半萜合酶环化起始控制机制将会为倍半萜合酶的理性设计，定向生成新型化合物奠定坚实基础。

倍半萜合酶的环化反应的特异性控制机制已经开展了非常深入广泛的研究，但是萜类合酶催化环化反应的起始控制机制还知之甚少。本项目的目标为明确为什么两个旁系同源酶采取了不同的氨基酸位点来控制环化反应的起始。经过过四年的研究，圆满完成了项目申请书中提出的研究计划，解决了项目提出的关键问题。.计划完成情况：1：明确了黄花蒿AaBFS催化生成(E)-β-farnesene的反应机理，确定(E)-β-farnesene的合成位置是在transoid farneyl cation（项目研究目标1）；2：明确了黄花蒿AaBFS Y402L突变催化环化反应的机理，确定NPP反应中间体是S构型（项目研究目标2）；3：黄花蒿AaADS T296V突变位阻效应的作用方式可能是直接影响底物（项目研究目标3）；4：在黄花蒿AaBOS中的296位（对应AaADS的295）、玉米ZmTPS10中的356氨基酸残基（对应AaBFS的402）均是控制环化反应功能能的关键氨基酸残基。表明这两个位点的关键性作用在倍半萜合酶中具有一定的普遍性（项目研究目标4）。.关键科学问题的回答：两个旁系同源酶采取不同的氨基酸位点来控制环化反应的起始，不是因为他们控制的反应步骤不同，而是因为两个酶的催化反应中间体NPP的手性不同，一个是S型，一个是R型。.在圆满完成目标计划之外，还获得了额外的重要研究发现。1：296位和402位氨基酸残基影响环化调控的是transoid farnesyl cation生成NPP这一步，而以上两位点的对侧的AaADS 439位（AaBFS 467位）氨基酸残基也影响环化，但是其调控位点是cisoid farnesyl cation的1，6环化这一步。2：我们发现了催化1，6环化的倍半萜合酶的手性控制现象：1，6环化后的6位C的手性和中间产物NPP的3位C手性相同。.以上这些发现将会为阐明倍半萜合酶的催化特异性机制、倍半萜合酶的理性设计、定向生成新型化合物奠定坚实基础。