Notch信号在骨髓窦状内皮细胞损伤后再生及造血重建中的作用研究

Acute injury to the bone marrow microenvironment, after treatment with repeated rounds of high-dose chemotherapy or irradiation or conditioning regimens before hematopoietic stem cell transplantation(HSCT) kills malignant cells, delays hematopoietic stem cell (HSC) engraftment and regeneration. Bone marrow (BM) sinusoidal endothelial cells (SECs) are one component of the HSC niche. Regeneration of BM SECs and angiogenesis play a key role in hematopoietic reconstitution following myelosuppressive injury. Notch signaling is required for the development of embryonic blood vessel. However, the roles of Notch signaling during adult SECs regeneration following injury are unknown.We designed and produced an endothelium-targeted soluble Notch ligand, the DSL domain of Delta-like 1 fused with a RGD motif (D1R), which enhanced hematopoietic reconstitution of the lethally irradiated mouse transplanted with a small quantity of HSCs. Our previous work showed that liver SECs degeneration and decreased proliferation were obvious in the regenerating liver of RBP-J– deficient mice. Thus, we speculated that Notch signaling may regulate BM SECs maintenance and regeneration. Herein, we shall utilize the transgenic mouse bearing a constitutive deletion of RBP-J in the endothelial cells and soluble Notch ligand D1R, to determine whether targeted disruption or activation of Notch pathway has the influence on BM SECs regeneration and hematopoietic reconstitution. Using this approach, we shall provide a sound theoretical basis for the later clinical application of Notch-based drugs.

反复多次大剂量化/放疗或造血干细胞移植前的预处理，在杀死恶性细胞的同时，也造成了严重的骨髓微环境破坏，影响了造血重建。骨髓窦状内皮细胞是造血干细胞龛的重要组成细胞。骨髓损伤抑制后，窦状内皮细胞的再生和新生血管的形成是造血重建的重要基础。Notch信号在胚胎血管发育中发挥重要作用，但对成年骨髓窦状内皮细胞损伤后再生的作用还未明确。我们发现内皮细胞靶向的Notch配体D1R蛋白可明显促进低剂量细胞移植的小鼠造血重建。条件性剔除RBP-J基因后，小鼠肝脏窦状内皮细胞变性明显，增殖减弱。由此我们推测骨髓窦状内皮细胞也很有可能受到Notch信号调节。本课题拟采用血管内皮细胞条件性RBP-J剔除小鼠模型和可溶性Notch配体D1R蛋白，分析阻断或活化Notch信号对骨髓窦状内皮细胞损伤后再生及造血重建的影响及相关分子机制，为深入研究基于Notch信号的药物在促进造血重建中的临床应用奠定基础。

反复大剂量化/放疗或造血干细胞移植前的预处理，在杀死恶性细胞的同时，也造成了严重的骨髓微环境破坏，影响了造血重建。骨髓窦状内皮细胞是造血干细胞龛的重要组成细胞。骨髓损伤抑制后，窦状内皮细胞的再生和新生血管的形成是造血重建的重要基础。Notch信号在胚胎血管发育中发挥重要作用，但对成年骨髓窦状内皮细胞损伤后再生的作用还未明确。研究发现内皮细胞靶向的Notch配体D1R蛋白可明显促进低剂量细胞移植的小鼠造血重建。条件性剔除RBP-J基因后，小鼠肝脏窦状内皮细胞变性明显，增殖减弱。由此我们推测骨髓窦状内皮细胞也很有可能受到Notch信号调节。本课题采用血管内皮细胞条件性RBP-J剔除小鼠模型和可溶性Notch配体D1R蛋白，分析阻断或活化Notch信号对骨髓窦状内皮细胞损伤后再生及造血重建的影响及相关分子机制。主要相关工作如下：1、基于Notch信号途径体外扩增体系的建立及优化：我们以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为支持细胞模拟体内造血微环境，联合应用人源性生长因子及Notch配体D1R蛋白（hD1R），成功地建立了基于Notch信号的体外扩增体系。研究发现hD1R蛋白通过锚定在生长良好的HUVEC表面，可有效激活Notch信号，达到最佳的扩增效率（扩增人脐血造血干/祖细胞CD34+细胞约87.5倍），其中约77％的扩增细胞处于G0/G1期，维持CD34+细胞增殖。将体外扩后细胞移植给NOD/SCID小鼠，并进行连续移植，发现hD1R组扩增的细胞在小鼠体内植入率明显高于其他组，能维持长期造血。2、体内激活Notch信号对造血重建的影响：通过放射线照射NOD/SCID小鼠后，取低剂量的脐血CD34+细胞进行移植，并同时给予移植小鼠腹腔注射hD1R蛋白，我们发现注射hD1R蛋白后的小鼠骨髓里细胞数明显增加，促进造血恢复。3、体内注射hD1R蛋白对骨髓微环境的影响：给照射后小鼠体内注射hD1R 蛋白，小鼠骨髓组织结构受损明显减轻、细胞增多、窦状内皮细胞结果更完整，显示了hD1R 蛋白对骨髓微环境明显的放射性保护作用。4、hD1R蛋白对归巢的影响：通过小鼠移植实验，发现hD1R明显提高了扩增细胞的归巢能力，主要是通过上调α4和α6整合素分子的表达而促进细胞归巢的。