黑曲霉糖代谢途径中关键酶与小分子相互作用的系统研究

Aspergillus niger is an interesting industrial microorganism that is able to grow at as low as pH 1.5 and convert inexpensive industrial feedstock into value-added enzymes or chemicals such as citric acid. In our previous study, we obtained system-level high-quality data on transcriptiomics, proteomics and metabolomics of citric acid industrial production process with A.niger, but it seems difficult to elucidate the metabolic regulatory mechanisms by merely reverse engineering of the time-series data. Protein-metabolite interaction is an important mean for the cell to fine -tune the metabolism economically and rapidly, and is also the Rosetta Stone to solve the above-mentioned question. In this study, we combine the modified Pull-down principle with the high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry technology (HPLC-MS/MS), in order to enrich and identify the metabolites which interact with the proteins from the central carbon metabolism of A.niger. We then apply the Surface Plasma Resonance (SPR) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) technology to quantify the metabolite-protein interaction dynamics. Taking all together, we wish to be able to unveil the metabolic regulation mechanism for A. niger's functioning as an efficient cell factory at systems and molecular level, and offer solid basis for thoroughly understanding the complex cellular life of this filamental fungus and for the re-design and optimization of an ideal cell factory.

黑曲霉是一种有趣的工业微生物，能够在pH低至1.5的环境下生长，并利用工业粗原料快速生产酶制剂、柠檬酸等对人类有用的物质。在前期工作中，我们对黑曲霉代谢过程的转录组、蛋白质组、代谢组进行了深入研究，但是对这些海量时间序列数据进行反向工程以破解细胞代谢调控生理机制的研究工作遇到了瓶颈。代谢物小分子与蛋白质分子的相互作用是细胞快速响应环境变化的重要精细调控机制，也是解决上述问题的关键之一。本申请将Pull-down原理与高效液相色谱-高分辨串联质谱联用技术相结合，筛选并鉴定与黑曲霉中央糖代谢途径关键蛋白质相互作用的小分子代谢物，利用表面等离子共振（SPR）与等温滴定量热法（ITC）精确表征所鉴定的小分子代谢物与蛋白质互作的动力学关系，逐步揭示黑曲霉作为高效细胞工厂的调控原理和运作机制，为理解生命过程、设计高效细胞工厂奠定基础。

代谢物小分子与蛋白质的相互作用是细胞快速响应环境变化的重要精细调控机制。本项目旨在结合小分子钓取、质谱鉴定和物理学互作定量多种研究方法，系统地研究在柠檬酸工业生产黑曲霉菌株糖代谢途径中关键酶蛋白与小分子代谢物的相互作用。通过本项目研究，我们建立了黑曲霉高效蛋白表达系统，实现了黑曲霉糖代谢关键酶的表达与纯化。为实现从胞内代谢物组中钓取与关键酶互作的小分子，我们系统评估并优化了黑曲霉胞内代谢物组样品制备的方法，建立液氮加快速抽滤的细胞无损淬灭方法以及热乙醇与冷乙腈结合的全胞内代谢物提取方法。本项目研究中最大的难点与挑战在于如何有效地从黑曲霉复杂的胞内代谢物钓取到与关键酶互作的小分子。研究之初，我们采用了基于Pull-down的小分子代谢钓取方法，并进行细致的实验设计。研究发现，该方法虽然在与单一小分子代谢物互作的测试实验中是具有可行性的，但从胞内代谢物中钓取小分子时，其稳定性与重现性相对较差。这可能与GST融合蛋白固定效率的不稳定以及融合蛋白固定后形成的空间位阻多样性有关。针对这一问题，我们进一步开发了基于超滤的小分子钓取方法，利用酶与小分子复合体与未结合小分子的分子大小差异来对与酶蛋白结合的小分子进行富集。结果表明，该方法的稳定性与重现性要比基于Pull-down的小分子钓取方法好。利用基于超滤的小分子钓取方法，结合以非靶向代谢组的质谱数据解析策略来发现与关键酶互作的小分子的方法，我们成功从高产柠檬酸的黑曲霉胞内代谢物中钓取到与糖代谢关键酶磷酸果糖激酶的互作小分子代谢物。经过小分子的结构鉴定后，发现钓取到的互作小分子，发现了一系列新的代谢调控关系。经表面等离子共振(SPR)检测证实这些新的代谢调控关系，即谷氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸与磷酸果糖激酶均存在明确互作，且亲和常数分别为24.7 mM、19.96 μM与4.45 μM。进一步的酶活检测证实焦谷氨酸与琥珀酸对磷酸果糖激酶具有显著的激活作用，并且具有浓度依赖性。整合前期研究结果与新发现的代谢调控关系，我们重构了黑曲霉中心代谢的代谢调控网络。本项目研究探索建立了一种基于超滤的蛋白与互作小分子的钓取方法，可有效从胞内代谢物鉴定发现新的代谢调控关系，不仅可促进整合多组学数据进行黑曲霉细胞网络的构建和模拟研究；同时本研究中开发完善的筛选-鉴定-定量方法将对综合利用组学数据实现对生命现象本质进行剖析提供方法借鉴。