重复序列元件在小鼠胚胎干细胞中的表达、调控及功能分析

Repetitive elements (REs) comprise a large portion of eukaryotic genome. Recent studies indicate that various REs express and are regulated tightly in cells. They have been associated with development and evolution and linked to the occurrence and progression of certain human diseases. Recently, the applicant discovered the role of Atrx/Daxx complex in protecting certain REs including endogenous retrotransposon (ERVKs) and telomeres in mouse embryonic stem cells (mES cells) and preimplantation embryos. In this project, we will extend the work by analyzing the large scale ChIP-Seq and RNA-Seq data from mES cells in GEO databases to screen the protein complexes and epigenetic markers which are enriched on REs. Constructing mES cell lines with overexpression and knockdown of selected genes as cell models, we will investigate the underlying mechanism of how these genes regulate the targeting REs by using NGS and Q-PCR technologies. The protein domains and DNA sequences mediating the interaction between related proteins and REs will be identified by Gel-Shelf experiment. These studies will elucidate the roles of these mechanisms in maintaining pluripotency，differentiation and genome integrity of stem cells. This work will deepen our understanding of functions and regulation mechanisms of REs significantly.

真核生物基因组中存在有大量重复序列元件。最新研究表明多种重复元件在哺乳动物细胞中显著表达，并被严格调控。它们与个体发育，物种进化和多种疾病的发生、发展密切相关。最近申请人发现Atrx/Daxx蛋白复合物在胚胎干细胞和早期小鼠胚胎中保护内源反转录转座子（ERVKs）和端粒的功能。本课题拟拓展该工作，利用GEO数据库中的大量小鼠胚胎干细胞ChIP-Seq和RNA-Seq数据，运用生物信息学手段，筛查富集在重复元件上的蛋白质复合物和表观遗学传标记。通过构建相应基因的诱导表达和缺失的干细胞系，用NGS和Q-PCR等技术，验证这些基因对目标重复序列的调控关系；用凝胶迁移等技术，鉴定介导相关蛋白质与重复元件结合的蛋白质结构域和DNA序列；并阐明这些调控机制在维持干细胞多能性、分化及保护基因组等方面的生理功能。该工作将显著深化我们对重复元件的调控机制和功能的理解。

项目的背景.重复序列包含了丰富的遗传信息，有着重要而复杂的生理功能，具有极高的理论及应用研究价值。快速发展的NGS技术使全面深入研究重复序列调控机制和功能成为可能。本项目运用分子生物学和生物系信息学手段，发现重复序列在胚胎干细胞及其他细胞中的表达规律，发现新的生理及病理功能，鉴定新的调控蛋白质，开发研究重复序列的生物信息学算法。.主要研究内容.1）.通过公开GEO等数据库，对包括胚胎干细胞在内大量细胞系重复序列元件的结合蛋白质和表观遗传标记进行鉴定,。.2）.采用分子生物学方法对发现的重复序列调控蛋白质在胚胎干细胞和其他细胞中的功能和机制做深入研究，并寻找其与癌症发生、发展的关联。.3）.开发新的生物信息学算法分析特殊类型重复序列的修饰谱和表达谱。..重要结果.1）.通过对大量NGS数据分析，发现ZBTB40, NFRKB是新的端粒结合蛋白，在胚胎干细胞及癌细胞与串联重复序列（端粒）结合的蛋白质。.2）.采用分子生物学方法，证明ZBTB40在胚胎干细胞和部分癌细胞系中结合在端粒上，保护端粒，并负调控端粒长度。对ZBTB40基因敲除小鼠研究表明，次级精母细胞中高表达，调控精子端粒长度，影响精子活力。.3）.采用分子生物学方法，发现NFRKB参与ALT细胞通路。其中NFRKB在胚胎干细胞中调控pml小体的形成。且其在肝癌细胞中高表达，且其表达水平与肝癌的预后有显著关系。.4）.开发了利用RNA-Seq数据准确测量重复序列tRNA的表达，剪切和修饰的软件tRNAExplorer, 并用该方法研究了tRNA在多种细胞系和人类组织的表达水平，发现了新的表达模式和修饰位点。.5）.开发了新生物信息学工具BCREval，以测端粒的DNA甲基化水平，评估WGBS测序中的亚硫酸盐处理转化效率。.6）.本项目也对重复序列来源的eccDNA在宫颈癌中的作用，做了初步研究。..关键数据及其科学意义..该项目发现了若干重复序列的调控因子，发现了其在胚胎干细胞和部分癌细胞系中的调控机制和功能，并研究了这些因子在发育和人类疾病发生发展中的作用。本项目发现了新的tRNA在人类细胞和组织中的表达，剪切和修饰模式。开发了两种新的生物系信息学工具和算法，加深对于重复序列的功能和调控机制的理解，促进了重复序列的功能研究。