基于Nrf2与HSF1协同神经化学兴奋效应探讨藁本内酯防治缺血性卒中的分子机制

Ischemic stroke with high incidence and mortality is a serious threat to the national health. With the aged trend of population and increased incidence in younger patients, effective prevention of ischemic stroke is extremely necessary and urgent. Currently, neurovascular unit has been recognized as the critical target for the prevention of ischemic stroke. Previous reports have proved the protective effect of Z-ligustilide on ischemic stroke. However, its effect on neurovascular unit is still not clear and the mechanisms are also needed for further explored. Moreover, the bioavailability of Z-ligustilide is very low and can't be detected in the brain. Our previous experiments have demonstrated that Z-ligustilide could activate the synergistic neurohormesis mediated by Nrf2 and HSF1. In this project, rat with transient middle cerebral artery occlusion (tMACO) and neurovascular unit successfully established in vitro by our group will be used as the models in vivo and in vitro. We will first prove the intranasal delivery is a reasonably practicable method for Z-ligustilide.Then, we will investigate the protective effect of Z-ligustilide on the early and later injury of neurovascular unit induced by ischemic stroke. With the technique of decoy oligodeoxynucleotides, we will further clarify whether the synergistic neurohormesis mediated by Nrf2 and HSF1 is the key molecular mechanism for Z-ligustilide's protection. Finally, the potential role of oxidative stress and electrophilic stress within this process will also be clarified. This project will provide novel theoretical foundation for prevention of ischemic stroke by Z-ligustilide and has important theoretical significance and application value.

缺血性卒中具高发病率与致死率，严重威胁国民健康。随着人口老龄化与发病低龄化，有效防治缺血性卒中，尤为必要与迫切。神经血管单元当前被认为是缺血性卒中防治的关键靶标。既往研究证实藁本内酯对缺血性卒中具保护作用，但对神经血管单元的作用还不清楚，作用机制亦需深入挖掘，且口服生物利用度非常低，不能到达脑部。我们前期发现藁本内酯能激活Nrf2与HSF1协同神经化学兴奋效应，本项目以暂时性大脑中动脉阻塞大鼠和课题组已成功建立的体外神经血管单元为缺血性卒中体内外模型，首先明确经鼻预处理是藁本内酯合理可行的给药方式。再考察藁本内酯对缺血性卒中损伤前期与后期神经血管单元的保护作用。然后利用诱骗寡核苷酸技术，阐明Nrf2与HSF1协同神经化学兴奋效应是否为藁本内酯作用的关键分子机制，最后阐明氧化和亲电子应激的潜在作用。本课题的实施将为藁本内酯用于缺血性卒中的防治提供新的理论依据，具重要的理论意义和应用价值。

缺血性卒中具高发病率与致死率，严重威胁国民健康。随着人口老龄化与发病低龄化，有效防治缺血性卒中，尤为必要与迫切。神经血管单元当前被认为是缺血性卒中防治的关键靶标。既往研究证实中药川芎与当归中的主要成分藁本内酯对缺血性卒中具保护作用，但作用机制需深入挖掘，且口服生物利用度非常低，不能到达脑部。本项目实施的主要内容包括：构建脑神经血管单元的体外细胞模型；在前期已经解析藁本内酯对Nrf2通路调控作用的基础上，进一步解析热休克蛋白HSP70的信号通路调控作用，并明确其在藁本内酯保护脑缺血体外细胞模型损伤上的作用；然后，在暂时性大脑中动脉阻塞大鼠上，考察藁本内酯对脑缺血神经血管单元损伤的影响以及Nrf2 与 HSP70协同神经化学兴奋效应的作用。最后，还对含川芎与当归的经典复方桃红四物汤抗脑缺血的作用与分子机制进行了系统解析。研究重要结果包括：成功构建了神经元、脑神经胶质细胞和脑微血管内皮细胞三细胞共培养的神经血管单元体外细胞模型；建立起一种简便分离与培养大鼠脑微血管内皮细胞的新型方法；证实与表征了藁本内酯对HSP70的诱导作用，发现其诱导作用是通过调控激活MAPKs通路，而非经典的HSF1通路；阐明藁本内酯调控HSP70通路是发挥体外抗氧糖剥夺损伤和降低泛素化蛋白聚集的关键分子机制；在动物模型上，证实了藁本内酯以鼻腔给药能显著降低缺血性卒中造成的神经血管单元损伤；分别采用诱骗寡核苷酸（Decoy ODN）技术和慢病毒载体介导的RNAi技术证明了Nrf2与HSP70协同神经化学兴奋效应是藁本内酯发挥脑缺血保护作用的主要分子机制；最后，在脑缺血MCAO动物模型和氧糖剥夺-再灌注细胞模型上，证实了桃红四物汤对脑缺血的防治作用；采用差异蛋白质组学方法系统解析了桃红四物汤作用的分子机制，发现Nrf2介导的Ⅱ相蛋白酶为作用的关键蛋白靶点；阐明了PI3K/Akt和Nrf2通路为桃红四物汤保护作用的关键分子机制。在此研究成果基础上，本项目已经发表学术论文6篇（SCI收录5篇，中文核心期刊1篇，另还有两篇在撰写和投稿中），撰写英文专业书籍章节1篇，参加学术会议交流4次（两次国际会议、两次国内会议）。本项目的研究意义：为藁本内酯和含藁本内酯的中药以及复方制剂用于缺血性卒中的防治提供新的理论依据，具重要的理论意义和应用价值。