保幼激素诱导白背飞虱短翅化过程中的DNA甲基化研究

稻飞虱有长翅和短翅二型现象，对其翅型分化的机制进行深入研究，将有助于预测预报该虫的发生动态，增进对昆虫翅多型现象本质的认识。目前认为各种生态因子对飞虱翅型分化的影响可能是通过调节体内保幼激素(JH)含量而达到的，高JH含量具有诱导短翅化作用，但具体机制不清。本项目在已经证明JH具有诱导白背飞虱短翅化作用且涉及到DNA甲基化的基础上，拟采用甲基化敏感的代表性差异分析技术探明与短翅型或长翅型白背飞虱相关联的特异DNA甲基化片段，再用生物信息学方法筛选具有启动子位点或处在第1外显子的CpG岛的序列片段，并利用染色体步移法克隆其邻近下游相应基因的序列，然后重点分析JH诱导白背飞虱短翅化过程中的这些特异片段的DNA甲基化动态变化过程及相关基因的表达谱，旨在阐明JH诱导白背飞虱短翅化的可能表观遗传机制，从而可进一步认识昆虫翅多型现象的本质，为寻找控制飞虱危害的新途径和新方法提供一定的理论基础。

稻飞虱有长翅和短翅二型现象，目前认为各种生态因子对飞虱翅型分化的影响可能是通过调节体内保幼激素含量而达到的，但具体机制不清。本项目在已经证明保幼激素具有诱导白背飞虱短翅化作用且涉及到DNA甲基化的基础上，拟筛选与短翅型或长翅型白背飞虱相关联的特异DNA甲基化片段，并分析这些片段在保幼激素诱导白背飞虱短翅化过程中的DNA甲基化动态变化过程及相关基因的表达谱。首先我们建立了一套适合稻飞虱的甲基化敏感性代表性差异分析方法和甲基化敏感的扩增多态性分析方法；对白背飞虱长、短翅型雌虫的基因组DNA甲基化进行差显分析，得到了两条与翅型相关连的特异甲基化片段，且分别与18S核糖体RNA和28S核糖体RNA基因同源，表明核糖体RNA基因的甲基化可能参与了稻飞虱翅型分化的调控；对白背飞虱长、短翅型雌虫的基因组进行甲基化敏感的扩增多态性分析，发现短翅型的全甲基化率为5.81%，明显高于长翅型的2.40%，而短翅型的半甲基化率为4.35%，明显低于长翅型的8.35%，并成功克隆到14个与翅型相关的特异性甲基化片段，且发现其中5个片段含有启动子序列特征；筛选了6个可能位于启动子或外显子区域的特异性甲基化片段进行了部分序列的克隆，并用亚硫酸氢钠测序法检测这些片段在白背飞虱发育过程中的甲基化动态变化谱式，发现它们在白背飞虱不同发育时期所呈现出的甲基化频率和式样明显不同，说明特定基因的甲基化与昆虫发育的具体时期紧密关联，同时也基本明确了这些特定的DNA甲基化片段在经保幼激素处理后的白背飞虱发育过程中的甲基化动态变化谱式及其对应基因表达变化式样；此外，我们还对褐飞虱长翅型与短翅型雌成虫的基因组DNA甲基化进行了分析研究，发现长、短翅型间甲基化式样差异同样显著，并克隆获得了30多条与翅型相关联的特异甲基化片段，其中有2条片段分别与18S和28S核糖体RNA基因同源，这与在白背飞虱中的研究结果高度一致，说明核糖体RNA基因的甲基化可能与所有稻飞虱种类的翅型分化有关，但具体机制还需进一步探索。本研究将有助于从DNA甲基化的角度解析JH诱导白背飞虱短翅化的可能表观遗传机制，增进对昆虫翅多型现象本质的认识。