抗HIV-1新型N肽融合抑制剂设计、合成及其性能研究

In HIV-cell membrane fusion, a six-helical bundle (6HB) formation between the N- and C-heptad repeat (NHR and CHR respectively) provide the energy for the membrane fusion, and finally results in HIV-1 infection. Fusion inhibitors inhibit viral-cell membrane fusion through preventing the 6HB formation. The clinical used T20 and most of fusion inhibitors in clinical study target the same NHR therefore cross drug-resistance between these inhibitors is common. Based on 6HB crystal structure, both NHR and CHR can be target. But N-peptides (derived from HIV-1 gp41 NHR) that target CHR are less active due to their self-aggregation in solution. High potent N-peptide fusion inhibitor should form stable trimer. Highly active N-peptide inhibitors have been achieved by fusion a N-peptide with a trimerized peptide template or by introducing disulfide bond at the terminal of a N-peptide so that stabilize the N-peptide trimer, however these modifications suffer from the resulted too long peptide chain or the difficulty to control the reaction of the disulfide bond formation. In this proposal, we plan design N-peptide fusion inhibitors based on a thioester transfer reaction we developed recently. Inter-chain covalent bond can be introduced at design sites in a controllable manner after properly coiled-coil assemble to obtain stable covalent linked N-peptide trimer with high anti-HIV activity, so that be used as novel class of fusion inhibitor targeting HIV-1 gp41 CHR. Because no isolated NHR structure or its complex with small molecule have been reported, the design N-peptide trimer can be used as target and NHR model to study the mechanism of fusion inhibitors and get new insight in the design of small molecule fusion inhibitors.

在HIV-细胞膜融合中，由gp41中N-和C-端螺旋区（NHR和CHR）形成关键六螺旋束(6HB),导致膜融合和感染。融合抑制剂可抑制6HB形成，从而抑制膜融合。已上市的T20及正在临床研究的C肽融合抑制剂均以NHR为靶标，药物间已有或预期出现交叉抗性。据6HB结构，NHR和CHR互为靶标。但以CHR为靶标的N肽分子自身易聚集、活性低，高活性N肽抑制剂为三聚体。前人通过增加辅助序列及形成端基二硫键可得到三聚体，提高活性，但肽序列过长，反应不可控。我们设计的N肽抑制剂可通过自组装和硫脂转移反应，在肽链之间的设计位点发生可控共价键，形成稳定的交联N肽三聚体，从而提高活性，得到以CHR为靶的新结构类型N肽融合抑制剂。另外，迄今尚无独立的NHR结构或其小分子复合物结构报道，上述交联N肽三聚体还可用作NHR标靶分子模型，综合研究融合抑制剂的作用机制，并为小分子融合抑制剂的设计提供结构参考。

在HIV-1细胞膜融合中，由gp41中N-和C-端螺旋区（NHR和CHR）形成关键六螺旋束(6HB),导致膜融合和感染。融合抑制剂可抑制6HB形成，从而抑制膜融合，阻断HIV感染宿主细胞。本文主要针对N肽融合抑制剂易聚集、生物活性低等缺点，通过对NHR序列进行修饰，氨基酸替换和异肽键交联的方法，设计出生物活性高，代谢稳定性高的N肽融合抑制剂。本文的研究主要分为两个部分：. 1、嵌合N肽的设计. 针对N肽的三聚体结构不稳定、易沉淀的缺点，我们首先从头设计能够形成三螺旋的人为α-螺旋肽序列，其长度为三个或四个七重复序列，它们可以自组装成为三螺旋结构，再通过侧链形成异肽键将三条肽链交联，最终得到异肽键交联的人为设计三螺旋(3HR)3，(4HR)3。然后，在3HR，4HR的C端嵌合天然NHR肽片段N23，得到了嵌合并交联的N肽(3HRN23)3，(4HRN23)3。我们确证了设计的N肽(3HRN23)3，(4HRN23)3均为稳定的三螺旋结构，α螺旋达到90%以上，并且表现出高生物活性（IC50达到10nM左右）和高代谢稳定性。该部分证明异肽键交联的方法可以有效的提高螺旋结构的稳定性和N肽的生物活性。. 2、以天然NHR序列为模板N三螺旋肽设计. 该部分直接以天然NHR序列为模板，并通过异肽键交联的方法设计出具有稳定三螺旋结构的N肽融合抑制剂。本研究中，通过对天然NHR序列的部分氨基酸替换，设计出能形成三螺旋结构的N肽N36MEK2，N36MEK1和N36M。并在该N肽的三螺旋结构基础上，利用异肽键交联的方法，得到异肽键交联的N肽融合抑制剂(N36MEK2)3，(N36MEK1)3和(N36M)3。异肽键交联的N肽具有较好的α螺旋（螺旋率80%以上）和热稳定性（Tm>90℃）。它们也表现出高生物活性和良好的代谢稳定性。尤其是(N36M)3不仅序列与天然N36序列非常接近，在细胞-细胞融合实验和真病毒实验中的抑制活性达到与T20相当或高于T20活性，而且还对HIV-1流行毒株和T20耐药毒株都具有很高的生物活性。此外，该NHR三股螺旋可以独立存在，突破了缺乏NHR三聚体模型作为小分子融合抑制剂分子靶标的关键难点，从而使得研究小分子与靶标NHR三聚体的晶体结构成为可能。