ADGRG2系链肽的筛选优化及其通过调节输出小管液体重吸收调控男性不育研究

Loss of function of ADGRG2 causes abnormal fluid reabsorption of efferent ductules in the male reproductive system, resulting in sperm retention and efferent ductule obstruction, consequently leading to male infertility. Our recent study found that ADGRG2 regulated fluid reabsorption of efferent ductules through CFTR activity mediated by Gq and β-arrestin-1, which was an important target for the treatment of male infertility. However, ADGRG2 is still an orphan receptor and lacks an effective strategy to interfere with its receptor activity. Our previous work screened for a tethered peptide that successfully activated ADGRG2, which opened a new window for the clinical application of ADGRG2. Further, we intend to optimize the ADGRG2-tethered peptide to obtain an effective tool for external control of ADGRG2 receptor activity. On this basis, a variety of genetically engineered mice combined with biochemistry, molecular biology, pharmacology, electrophysiology and other experimental methods will be used to study in vivo the effect and mechanism of ADGRG2-tethered peptide on the fluid reabsorption of efferent ductules, and to explore the therapeutic action of ADGRG2-tethered peptide on male sterile mice. This study will further deepen the research on clinical application of ADGRG2 and provide a new strategy for the male infertility therapy.

ADGRG2功能缺失使男性生殖系统中输出小管液体重吸收发生异常，造成精子滞留和输出小管梗阻，从而导致男性不育。我们最新研究发现ADGRG2通过Gq和β-arrestin-1介导的CFTR活性调节输出小管的液体重吸收，是治疗男性不育的一个重要靶点。然而ADGRG2目前仍是孤儿受体，缺乏有效的干预受体活性的策略。我们前期工作筛选了可以成功激活ADGRG2的系链肽，这为ADGRG2的临床应用开启了一个新的窗口。进一步的，我们拟优化ADGRG2系链肽，获得能够外部操控ADGRG2受体活性的有效工具。在此基础上，综合利用多种基因工程小鼠，结合生物化学、分子生物学、药理学和电生理等多种实验方法和手段，在体内深入研究ADGRG2系链肽对输出小管液体重吸收的影响和调控机制，并探讨ADGRG2系链肽对雄性不育小鼠的治疗作用。本研究将进一步深化ADGRG2的临床应用研究，并为男性不育的治疗提供一个新的策略。

近年来，男性不育症发病率持续上升。ADGRG2功能缺失使男性生殖系统中输出小管液体重吸收发生异常，造成精子滞留和输出小管梗阻，从而导致男性不育。我们研究发现ADGRG2通过Gq和β-arrestin-1介导的CFTR活性调节输出小管的液体重吸收，是治疗男性不育的一个重要靶点。对ADGRG2的功能、遗传变异和工作机制的了解，以及与这些特定功能相关的药物和配体为男性不育治疗的新发展提供了未来的方向和巨大的“武器库”。然而ADGRG2目前仍是孤儿受体，从而限制了研究ADGRG2活性的工具。研究表明ADGRG2可以被系链肽p15激活，该系链肽来自于ADGRG2自身的N末端区域的被称为Stachel序列的部分，然而p15的低亲和力限制了其在ADGRG2表征研究中的实用性。课题组使用丙氨酸扫描突变来检测p15诱导ADGRG2激活过程中的关键残基。接下来设计了使用天然和非天然氨基酸取代优化ADGRG2的系链肽的系统策略。获得了一种优化的ADGRG2系链肽T1V/F3Phe(4-Me)（VPM-p15），其以显著提高（超过两个数量级）的亲和力激活了ADGRG2。然后，课题组对ADGRG2中响应VPM-p15的关键残基进行了测定，发现拨动开关W6.53和ADGRG2中ECL2区的残基是与VPM-p15相互作用、以及VPM-p15诱导Gs或arrestin信号的关键。本研究不仅为ADGRG2的功能研究提供了有用的工具，还为指导进一步优化系链肽以激活粘附GPCR成员提供了新的见解。ADGRG2被认为是CBAVD发病的重要遗传因素。已经从CBAVD患者中分离出一些ADGRG2突变，但其功能作用尚不清楚。课题组通过药理学和电生理方法证明了4种错义突变显示出受损的基础和激动剂VPM-p15促进的Gs/Gq活性，以及减少VPM-p15促进的β-arrestin-1募集，导致CFTR介导的全细胞Cl-电流降低。研究结果提示，ADGRG2的致病性突变致使下游的G 蛋白、arrestin和 CFTR 偶联的损伤可能与CBAVD发展高度相关，同时VPM-p15具有潜在的治疗作用。