基于定向进化技术的L-阿拉伯糖异构酶分子改造研究

L-arabinose isomerase (L-AI) is possibily the next aldose isomerase for industrial preparation after glucose isomerase. The mechanisms of substrate specificity, thermostability, and acidotolerance are the hot topics on L-AI researchs. The enzyme modification and function improvement are essential for industrial application of L-AI. In this project, based on the analysis of relationship between structure and function of L-AI, which is being developed under the support of previous NSFC project, we will use directed evolution technology, including error-prone PCR and DNA shuffling, and high efficiency screening technology through carbazole-sulfuric acid method, to obtain beneficial mutants, and realize the improvement of L-AI function, like enzyme activity, substrate specificity, thermostability, and acidotolerance. In addition, we will deeply research on the comparison of the properties and structure of between wild L-AI and beneficial mutants, then, using circular dichroism and differential scanning calorimetry measurement, and site-directed mutation and computational design technology, we will try to study the structure-function relationship and catalysis mechanisms of L-AI, including the mechanisms of substrate specificity, thermostability, weak acid tolerance and metal ion dependence.

L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）有望成为继葡萄糖异构酶之后第二个工业化应用的醛酮糖异构酶；底物特异性、热稳定性、弱酸稳定性等机理研究及分子改造是近年L-AI基础研究热点，亦是L-AI实现工业化应用的必备条件。本项目拟在前期L-阿拉伯糖异构酶结构与功能关系解析的（青年自然基金）研究基础上，通过易错PCR、DNA重排（DNA shuffling）、基因家族重排等酶定向进化技术，结合硫酸咔唑法高效筛选获得有益突变体酶，实现L-AI定向改造与功能优化，以提高酶反应活力及热稳定性，改善底物特异性及弱酸稳定性，构建适用于D-塔格糖生物合成产业化应用的突变体酶；同时通过野生酶与突变体酶的性质比较，利用圆二色（CD）、示差扫描量热（DSC）、定点突变等技术，结合计算机模拟辅助技术，深入研究L-AI的底物特异性、热稳定性、弱酸稳定性及金属离子依赖性等分子机制。

耐热菌Alicyclobacillus hesperidum URH17-3-68中编码L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）的基因片段，在NCBI中的编码为URH17368_0701。通过基因合成技术合成目的基因片段，连接至pET-22b(+)表达载体，形成重组质粒。将其转化至感受态细胞E. coli BL21(DE3)中，使用IPTG诱导蛋白过量表达，然后将重组酶经热处理及DEAE阴离子交换柱纯化，并对纯化后的酶进行SDS-PAGE。检测发现，纯化后的A. hesperidum L-AI在约56 kDa处出现特征蛋白条带，这与理论推测分子量相一致。研究酶学性质发现，重组酶的最适反应pH为7.0，最适反应温度为70 °C。该酶有较宽的pH作用范围（pH 5.5~7.0），并且在此pH范围内稳定性较好。该酶为离子依赖型酶，Co2+和Mn2+均能显著提高酶活，Co2+的催化效果更强。该酶在65 °C以下热稳定性较好，而温度达75 °C时，Co2+能够显著提高酶的热稳定性。当以D-半乳糖或L-阿拉伯糖为反应底物时，测得该酶动力学参数Km分别为：54.7 mmol/L和105.2 mmol/L。为获得酶活提高且最适pH降低的L-AI，通过定向进化对酶分子进行改造。采用易错PCR技术，构建突变体库，筛选获得酶活提高的正向突变体D478N。随后，采用定点突变技术，在478位构建突变体D478Q、D478A、D478K和D478R。将获得的突变体酶进行分离纯化及性质的测定。研究突变体酶学性质发现，5个突变体酶的最适温度均在60 °C以上；除了D478A，其他突变体的最适pH均下降，在pH 6.0~6.5范围内。所有突变体均需Co2+或Mn2+促进酶活的表达。测定发现突变体D478N和D478Q对D-半乳糖的催化效率高于野生型L-AI。在酸性环境下（pH 6.0），测定D478N、D478Q及野生型酶催化D-半乳糖异构化，实验结果显示D478N和D478Q对D-半乳糖的平衡转化率明显高于野生型酶。以大肠杆菌L-AI晶体结构为模板，模拟获得A. hesperidum L-AI的结构模型。模型显示478位氨基酸位于酶分子表面，推测其带电状态会影响底物与酶结合或异构化反应的最适pH。但对于478位的氨基酸如何影响酶的最适pH及其活力，还需对酶的晶体结构及其与底物的结合情况做进一步研究。