新型配子体雄性不育细胞质线粒体组型的鉴定研究

野生稻是重要的基因资源库，发掘利用野生稻中的重要农艺性状基因对水稻遗传改良具有重要现实意义。本研究以普通野生稻中发现、培育的配子体细胞质雄性不育系w15A、w20A、w34A、w46A为对象，通过对线粒体呼吸链复合物的活性分析，检测其可能存在缺陷的复合物，并分析其亚基组成。同时，利用PCR、RFLP等方法从线粒体基因组比较分析其主要功能基因的结构和序列差异以及蛋白编码基因的拷贝数等结构特征，确定各自特定的基因组型。进而利用线粒体基因组特征性差异片段开发其各自的特异性分子标记，建立与其相配套的鉴定技术体系，为进一步利用这些雄性不育细胞质资源奠定基础。

为了系统鉴定W15A、W20A等新型配子体细胞质雄性不育系线粒体组型，我们利用生物信息学结合分子生物学开发出两套细胞质雄性不育线粒体组型特异分子标记，结合恢保关系和遗传分析，确定了这5个细胞质属于不同的雄性不育类型，为这些细胞质雄性不育系的利用奠定了基础。.（1）以5个不育系超纯线粒体基因组DNA为材料，通过RAPD筛选获得38对多态性稳定的SCAR分子标记。利用线粒体基因组特异序列分析转化成功的38对SCAR分子标记我们发现，有16对SCAR分子标记扩增的目的序列定位到线粒体基因组，进一步分析发现所有的SCAR分子标记位点都处于线粒体功能基因上或附近，基本覆盖整个基因组，其中MS2、MS13位于nad2、cox2基因内，其中在基因组220-270kb分布的分子标记最多，由于这段区域重复序列较多，可能是一个重组热点，因此产生较多的多态性分子标记。.（2）通过对野败、里德型和CW型等5个线粒体基因组比对分析，共鉴定到47个大于100 bp的线粒体组型特异序列（MSS）位点。利用MSS特异序列作标记，PCR扩增扫描细胞质来源不同的粤泰A、W15A、W20A等7个配子体不育系和珍汕97A、马协A、Ⅱ-32A 等7个孢子体不育系及其相应保持系。发现共有3对引物只在所有的不育系中扩增出相应的条带，为不育细胞质特异序列片段；有9对标记只存在于所有的孢子体不育系，为孢子体所特有；有4对引物为配子体不育系特有。这些与细胞质雄性不育完全连锁的MSS，可作为高度特异的分子标记鉴定不育系、区分孢子体不育和配子体不育，这对于不育系的分子标记辅助选择、不育系及杂交稻的鉴定具有非常重要意义。.（3） 用SCAR分子标记对w15A、w20A、w34A、w46A和粤泰A等5个不育系进行多态性扩增和聚类分析发现，这些配子体不育系细胞质可分为3类：W15A和粤泰A为一类，W20A与W46A聚在一起，而W34A单独一类。选择其中4个SCAR标记同时对5个配子体不育系线粒体DNA进行扩增，可一次性将5个不育系的细胞质的多态性差异呈现开来。进一步的测恢分析表明，31个恢复系大部分对这5个不育系的恢保关系一致，但谷甫矮对W15A保持，98QJ对W15A、W46A强恢，N03S95对W34A强恢，对其他不育系保持。由此从分子和遗传证明这5个不育系属于不同的雄性不育细胞质类型。