Sidt2介导的甘油三酯转运异常在脂代谢中的作用及机制研究

In view of the complexity of lipid metabolism disorders, the mechanism remains unclear. Lysosomes are important subcellular organelles, but their association with lipid metabolism is poorly understood. Sidt2 is our newly discovered lysosomal membrane protein (LMP), and  Sidt2-/- mice show a significant lipid metabolism disorder, including dyslipidemia and severe spontaneous hepatic steatosis. Serious steatosis and triglyceride (TG) accumulation are also observed in the selective liver knockout Sidt2 mice, meanwhile liver is the core of lipid metabolism. Recently, we studied on the liver TG synthesis, oxidation, transport and found that the key fatty acid synthase such as ACC and FASN were significantly down-regulated, suggesting that the synthesis of TG was not increased, while the inhibition of TG was enhanced significantly. In addition, liver PPARa protein levels were significantly increased, indicating that its oxidative capacity on fatty acids was enhanced rather than decreased. So we speculated that the process of liver transporting TG could be disordered. VLDL, a main lipoprotein that transports TG from liver, emerged obvious abnormalities in Sidt2-/- mice by detecting the VLDL synthesis and secretion related regulatory protein. Therefore,this project is aimed at exploring the role and mechanism of Sidt2 on TG transport by detecting the effect of Sidt2 on VLDL synthesis and secretion as well as further understanding LMP function and the pathogenesis of lipid metabolism disorders.

鉴于脂代谢紊乱的复杂性，其机制仍未阐明。溶酶体是重要亚细胞器，但对其与脂代谢的相关性知之甚少。Sidt2是我们早期新发现的溶酶体膜蛋白（LMP），对小鼠Sidt2全剔除后表现出明显的脂代谢紊乱，包括血脂异常及严重自发肝脂肪变。肝是脂代谢核心，对肝选择性剔除Sidt2后也出现明显脂肪变，表现为甘油三酯（TG）严重堆积。对肝脏TG合成、氧化、转运三个环节排查发现，Sidt2L-/-小鼠肝TG合成并无增加，而受到严重抑制，表现为ACC、FASN等脂肪酸合成关键酶显著下调。此外肝PPARa蛋白水平明显增高，说明其对脂肪酸氧化能力并无受损反而激活。因此我们推测TG在肝脏转运环节出现障碍。VLDL是转运TG出肝的主要脂蛋白，对VLDL形成分泌有关的调节蛋白检测发现其存在明显异常。因此项目将从Sidt2对VLDL 形成分泌影响为轴探讨Sidt2与TG转运的相关机制，深化LMP功能与脂代谢

背景及主要内容：本课题在前期研究的基础上，我们发现Sidt2基因缺失后的肝脏发生了脂质堆积。我们推测这种Sidt2基因缺失后的肝脏脂质堆积很有可能是TG的分泌转运障碍导致的。为了进一步探究Sidt2基因缺失后肝脏脂质堆积的原因，我们对肝脏TG的分泌转运进行了研究，本实验以 Sidt2-/-的肝脏细胞（HL7702）作为离体模型,在不同状态（正常，高脂）下从TG合成，脂肪酸的β氧化以及VLDL的转运分泌三方面入手，检测相关蛋白的表达状态。与TG合成的相关酶Lipin-1、SCD1、 DGAT1 等。与脂肪酸β氧化的相关蛋白SCD1，与VLDL 合成及转运相关的蛋白， 包括VLDL合成直接相关的结构蛋白ApoB以及转运脂肪所必需的MTP，在 ER 腔内帮助ApoB正确折叠的蛋白如PDI、BiP、GRP94，及与VLDL在ER和Golgi及细胞膜之间的转运分泌起主要作用的囊泡运输相关蛋白，如ABCA1、CNX、GM130等都是影响含VLDL囊泡在细胞内运输的重要蛋白因子。在Sidt2对肝脏自噬的调节研究中，主要从关键蛋白LC3B和P62的表达，及自噬溶酶体降解途径的相关检测进行研究。.结 果：1、成功构建了Sidt2敲除的人肝脏细胞系（HL7702）；2、基础培养下，HL7702细胞中Sidt2的缺失导致脂代谢发生紊乱，TG生成减少脂肪酸β氧化增加，VLDL在内质网与高尔基体之间的转运增强，介导高尔基体向细胞膜的转运 关键蛋白表达降低；3、棕榈酸环境下，HL7702细胞中Sidt2的缺失导致TG的生成增多、脂肪酸的β氧化降低，VLDL在内质网与高尔基体之间的转运与分泌障碍；4、HL7702细胞中Sidt2剔除后LC3B和P62蛋白表达增加，同时进入自噬溶酶体降解系统的P62减少，自噬溶酶体途径受阻；5、 Sidt2基因缺失后自噬溶酶体形成障碍是自噬受阻的重要原因。.以上结果说明：基础条件下，Sidt2基因缺失抑制TG的生成及脂肪酸的β氧化，TG 在内质网与高尔基体之间的转运及分泌增强，介导高尔基体向细胞膜的转运及分泌的关键蛋白减少，提示VLDL在高尔基体与细胞膜的转运异常，同时自噬溶的形成及降解途径受阻导致肝脏细胞中脂质堆积。高脂环境诱导下，Sidt2的缺失导致TG生成增多，脂肪酸的β氧化降低，同时VLDL在内质网与高尔基体之间的转运及分泌障碍，脂质堆积。