卫星RNA选择性抑制CMV RNA1和RNA2复制的结构基础及其作用机制

It is a common biological phenomenon that cucumber mosaic virus (CMV) carries a satellite RNA (satRNA). Infection with satRNA usually reduces CMV accumulation, thus attenuates CMV-induced symptoms. However, the intrinsic mechanism is largely unknown. Our previous finding shows that the isolate T1 of satRNA selectively inhibits replication of RNAs 1 and 2 of CMV. On the basis of this finding, this proposal will determine the RNA structure of sat-T1 by selectively 2’-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE), combined with bioinformatic prediction and biological assays of mutants. Subsequently, an effort will be made to seek and determine benign domains by which sat-T1 inhibits replication of CMV RNA1 and RNA2. Finally, functional basis by which sat-T1 inhibits replication of CMV RNA1 and RNA2 would be explored by analyzing interaction of the benign domain of sat-T1 with CMV RNA1 and RNA2 or with host protein factors, which would dissect a novel mechanism of attenuating CMV-induced symptom expression by sat-T1. If working well with the project, it would provide a new target and strategy for development and establishment of novel anti-CMV methods.

黄瓜花叶病毒（CMV）携带卫星RNA（satRNA）是一种普遍的生物学现象。satRNA的侵染通常会降低CMV的积累，从而减轻病毒的症状。但是，satRNA致弱的分子机制仍知之甚少。前期研究发现：satRNA T1分离物（sat-T1）选择性地抑制CMV RNA1和RNA2的复制。本项目以此作为出发点，将通过选择性的2’羟基酰基化和引物延伸（SHAPE）的方法，结合生物信息学手段和突变体的生物学实验，确定sat-T1的RNA结构。在此基础上，寻找和测定sat-T1抑制CMV RNA1和RNA2复制的致弱功能域。最后从致弱功能域RNA与CMV RNA1和RNA2分子间的互作、致弱功能域RNA与寄主蛋白因子的互作两方面进行分析，阐明sat-T1抑制CMV RNA1和RNA2复制的作用机理，揭示sat-T1减轻病毒症状的新机制。该项目的顺利实施有望为开发和建立抗CMV新方法提供新的靶点和策略。

在自然界，部分黄瓜花叶病毒（CMV）会携带一类不编码任何蛋白的卫星RNA。卫星RNA完全依赖辅助病毒进行复制、包被、移动和传播。在多数情况下，卫星RNA 的侵染有效地抑制辅助病毒的积累和减轻病毒的致病性。然而，卫星RNA是如何致弱辅助病毒的分子机理仍有到研究。通过本项目研究，我们发现卫星RNA T1分离物选择性地抑制CMV 基因组RNA1和RNA2的复制，然而对RNA3的复制不产生明显影响。卫星RNA SD分离物也表现出相似的抑制作用，但是分离物D4则对RNA1和RNA2的复制不产生明显的抑制作用。在此发现的基础上，我们通过序列比对和RNA结构分析，发现它们的差异能力与卫星RNA是否形成一个γ形状的RNA元件（γ-shaped RNA element，γRE）有关。γRE突变体实验证实γRE就是卫星RNA选择性抑制CMV RNA1和RNA2复制的功能元件。在此基础上，我们通过pull-down实验，成功分离鉴定了9个与γRE互作的寄主蛋白，并利用烟草脆裂病毒（TRV）诱导的基因下调技术，确定了NbH3（组蛋白3）、GTPase Ran3（GTP酶 Ran3）、eIF4A（翻译起始因子4A）三个寄主因子在CMV/卫星RNA复制中的重要作用。综上所述，本项目系统地阐述了卫星RNA致弱辅助病毒得到分子机理：卫星RNA利用其γRE元件与辅助病毒基因组RNA1和RNA2竞争与其复制相关的寄主因子（可能为NbH3、GTPase Ran3、eIF4A），从而选择性抑制RNA1和RNA2的复制，降低病毒的积累，从而减轻辅助病毒引起的病害症状。