正己烷中毒性神经病神经丝含量下降的机制研究

正己烷可引起慢性中毒性周围神经病，轴突萎缩是其特异的病理改变。神经丝 (neurofilament,NF)是神经细胞内最为丰富的一种骨架成分, 控制粗大有髓鞘轴突的延伸生长，决定轴突直径。NF含量在中毒大鼠中枢和外周神经组织中均明显下降，并且停止染毒后随着大鼠神经症状的缓慢改善又表现出明显的恢复，提示NF含量的减少与疾病的发生密切相关。我们假设正己烷中毒性神经病NF含量下降与泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）活化、增强NF降解有关。围绕UPS加速NF降解为中心，建立细胞和大鼠中毒模型研究识别NF的E3连接酶、E3连接酶对NF的泛素化、NF泛素化所需因子或相关蛋白以及UPS系统各组分在中枢和外周神经组织的改变，并探索蛋白酶体抑制剂的治疗作用等来进一步阐明正己烷中毒性周围神经病的发病机制，为临床治疗和预防提供依据。

神经丝（Neurofilaments，NFs）是神经组织中最为丰富的一种骨架成分，由高分子量神经丝(NF-H)、中分子量神经丝(NF-M)和低分子量神经丝(NF-L)组成，控制着粗大有髓鞘轴突的延伸生长，决定轴突的直径。我们前期研究显示，2,5-己二酮中毒动物周围神经中NFs含量明显下降，是正己烷中毒神经病的特征性病理改变-轴突萎缩的病理学基础，并与大鼠神经行为改变相关。在国家自然基金资助下，我们采用正己烷的终毒物2,5-己二酮，分别利用体外培养体系和体内动物模型探讨了正己烷中毒性周围神经病 NFs 含量下降的机制。.将2,5-己二酮和蛋白酶体抑制剂 MG132加入到大鼠大脑皮层神经元的体外培养体系中，结果提示UPS活性增加是引起NFs下降的重要原因。将Flag-NFM质粒转染HEK293细胞使其高表达NF-M，pulse-chase实验结果也显示2,5-己二酮通过增强蛋白酶体活性降解NFs。CHIP是含U-box结构域的E3连接酶，能识别目标蛋白，并能与蛋白直接相互作用。将Flag-NFM 和 Myc-CHIP 质粒同时转染HEK293 细胞， EZview Red ANTI-FLAGM2 Affinity Gel 免疫沉淀实验和GST pull-down 实验证实CHIP与NFM存在直接作用。将Flag-NFM、Myc-CHIP和/或HA-Ub质粒分别或同时转染HEK293细胞，并加入2,5-己二酮，经EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel免疫沉淀后，Western blotting 检测发现 CHIP 促进NF-M泛素化，2,5-己二酮能够增强CHIP的促进作用。.采用2,5-己二酮腹腔注射染毒建立中毒性周围神经病的大鼠模型，Western blotting 观察到2,5-己二酮明显增强坐骨神经中泛素活化酶E1和连接酶CHIP含量、并增强大鼠坐骨神经和大脑中的蛋白泛素化。荧光底物检测26S蛋白酶体的三种蛋白酶活性，结果显示2,5-己二酮明显升高大脑的糜蛋白酶样和胰蛋白酶样，以及增强坐骨神经中胰蛋白酶样活性。2,5-己二酮能够导致大脑和坐骨神经中4--HNE修饰蛋白质明显升高，研究显示NFs是神经系统中4-HNE最主要的靶分子，NFs的氧化修饰可能激活了UPS，使其降解。