能有效治疗实验性强直性脊柱炎的全新型治疗性DNA疫苗的研制及其机理研究

针对强直性脊柱炎（ankylosing spondilitis,AS）尚无特异性疗法的现状，结合既往研究中发现HLA-B27重链拮抗肽能有效封闭HLA-B27分子的实验基础，本项目提出 HLA-B27重链拮抗肽特异性封闭B27分子作为分子模拟抗原或对关节源性肽的提呈而阻断自身免疫反应的假设，拟采用治疗性DNA疫苗的策略，在动物模型中从根本上逆转AS病理性免疫失调状态，以期重建或恢复机体的正常免疫体系。为此,本研究采用流式细胞筛选、ELISA、ELISPOT等技术，利用基于HLA-B27重链拮抗肽的治疗性DNA疫苗的基因免疫治疗方法，在大鼠AS模型中，观察B27重链拮抗肽的免疫原性、调节性细胞与细胞因子的变化以及机体免疫系统的恢复情况、疾病进程以及全身状况等。通过深入研究AS的免疫学致病机理，探讨该新型治疗性DNA疫苗治疗AS的科学性、可行性以及安全性，为有效治疗AS提供新的思路和科学数据。

背景：强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是严重危害人类身体健康的慢性全身性免疫性疾病。我国总患病人数约400-600万，基因或DNA 治疗性疫苗是近年来AS治疗研究最活跃的领域之一。然而，目前国际上尚无特异性针对HLA-B27抗原的AS治疗性DNA疫苗。. 目的：研究HLA-B27基因多态性及非MHC基因多态性与AS的关系；建立基于HLA-B27拮抗肽（antagonist peptide，AP）的新型治疗性DNA疫苗，通过特异性封闭B27肽结合位点，以阻断B27异常引起的免疫病理反应。. 方法：本研究首次在北方汉族人群中通过大宗病例对照来研究HLA-B27基因多态性及ANTXR2、ERAP1以及TNFAIP3基因多态性与AS遗传易感性。对 HLA-B*2705重链-AP 进行了 pcDNA3.1 真核表达载体的构建和表达鉴定，并对其生物学活性进行了初步研究。对 HLA-B*2705重链α1α2结构域-AP 进行了 pcDNA3.1 真核表达载体的构建和表达鉴定，并对其生物学活性进行了初步研究。将HLA-B*2705重链α1α2结构域-AP与HLA-B*2705重链-AP同时进行B27抗体与B27阳性细胞结合的阻断实验。制备HLA-B*2705+/β2m+/+ C57BL转基因小鼠模型并将其与鼠β2m-/-小鼠模型进行杂交，筛选HLA-B*2705+/人β2m+/+/鼠β2m-/-小鼠模型。. 结果及意义：首次在北方汉族人群中证实了HLA-B27基因多态性及ANTXR2、ERAP1以及TNFAIP3基因多态性与AS的遗传易感性。分别成功构建了含HLA-B*2705重链以及α1α2结构域基因的原核表达载体，并获得可溶性蛋白。筛选出与HLA-B*2705分子高度亲和的拮抗肽。成功构建含拮抗肽DNA序列的pcDNA3.1真核表达载体，转染COS7细胞，获高效表达。该拮抗肽能够成功阻断B27抗体与B27阳性细胞的结合，而且HLA-B*2705重链α1α2结构域-AP较HLA-B*2705重链-AP阻断效果更明显。成功筛选出纯合HLA-B*2705+人β2m+鼠β2m-小鼠模型。以上研究为后续的基于HLA-B27拮抗肽的治疗性DNA疫苗在强直性脊柱炎模型中的疗效观察和机制研究提供了实验基础和动物模型。.