改变脂质A脂肪酸链长度制备去内毒素活性的农杆菌

Agrobacterium is widely used to deliver the target gene into plants for the production of proteins. However, these purified proteins are always contaminated with lipopolysaccharide (LPS) that triggers stong immune responses leads to uncontrolled production of pro-inflammatory cytokines. It is currently known that deletion of fatty acid chains and phosphate groups of lipid A could reduce the endotoxin activity. However, the effect of alteration in fatty acid chain length on the LPS activity is still unclear. Our previous result shown that changing the length of Salmonella lipid A fatty acid chain from C14 to C10 could lower the inflammatory cytokine expression. Therefore, we speculate that it could be a good strategy to develop Agrobacterium mutants with low endotoxin activity by shortening the length of acyl chain. Therefore, In this study, we will construct the Agrobacterium mutants by modifying fatty acid chains structure with the length from C10 to C18. Then, we will observe the effect of different length of fatty acid chains on the endotoxin activity in the cell and animal models. Based on the shorter length of fatty acid structure, an ideal Agrobacterium mutant with no endotoxin activity will be constructed by incorporating the combination strategy including deletion the long fatty acid chain and phosphates. The opitimization Agrobacterium mutant could reduce the LPS purification process, lower the costs of protein production, and improve the plant expression platform with great market application prospects.

农杆菌被广泛应用于运载外源基因在植物中表达蛋白类药物。但农杆菌的脂多糖（LPS）会残留于蛋白中并诱发机体产生过激的炎症反应。目前已知去除LPS脂质A磷酸基团和脂肪酸链可降低内毒素活性，但关于脂质A脂肪酸的长度对内毒素活性的影响尚不明确。前期结果显示改变沙门氏菌的部分脂肪酸链从C14到C10，可显著降低细菌LPS的内毒素活性。因此，我们推测缩短脂肪酸链可能是构建低内毒素活性农杆菌的一种策略。本研究拟构建全部链长分别为C10、C12、C14、C16或C18的农杆菌突变株，观察不同链长的LPS在细胞和动物模型上诱导炎症反应的差异。寻找诱导最低LPS活性的链长结构，并以此为基础进一步去除脂质A的次级脂肪酸链和磷酸基团，获得一株理想的去内毒素活性且不影响细菌感染植物表达蛋白功能的农杆菌。新的农杆菌工程菌可以减少蛋白去LPS纯化的过程，节约药物生产的成本，完善植物表达平台，具有巨大的市场应用前景。

农杆菌被广泛应用于植物瞬时蛋白表达系统。但农杆菌的脂多糖（LPS）会残留于蛋白中并诱发机体产生过激的炎症反应。目前已知去除LPS脂质A磷酸基团和脂肪酸链可降低内毒素活性，但关于其脂肪酸链的长度对内毒素活性的影响尚不明确。影响脂肪酸链长度的关键因素是细菌自身乙酰转移酶选择底物的偏好性。本研究将其他细菌的乙酰转移酶基因插入农杆菌GV3101基因组来构建了脂肪酸链长分别为C10-C18的农杆菌突变株，并观察了不同脂肪酸链长的LPS诱导炎症反应的差异。结果发现，C10 GV3101来源的LPS在人和小鼠巨噬细胞中诱导最低水平的TNF-α，且其与MD2在细胞内外的结合能力最弱。而且，C10 LPS在家兔内毒素发热和小鼠肺炎模型中诱导的体温上升及肺炎指征也是最弱的。同时，本研究还构建了C10脂肪酸链的沙门氏菌突变株，发现其也能显著降低沙门氏菌LPS的活性。此外，本研究还在C10农杆菌基础上进一步去除了单磷酸基团和C28次级长脂肪酸链，获得了一株较为理想的低内毒素活性农杆菌C10-mono GV3101。其功能实验显示其感染烟草表达 GFP和ZV54抗体的能力正常，且ZV54抗体结合抗原及中和寨卡病毒的能力与野生型GV3101相当，这充分说明了对农杆菌脂质A的改造可降低内毒素活性且不影响植物表达蛋白的功能。有意思的是，本研究还将编码农杆菌C28次级长脂肪酸链的基因lpxXL 转移到沙门氏菌中，发现突变后的沙门氏菌的毒力明显下降，且可作为减毒活疫苗来抵抗野生致病性沙门氏菌的攻击。因此，构建C10-mono GV3101工程菌有望大大减少了植物表达的蛋白类药物纯化的工艺过程，节省药物生产的时间与经济成本，具有较大的市场应用前景。此外，对细菌脂质 A脂肪酸链长度与LPS活性的相关性研究还可以为免疫刺激性佐剂和细菌活疫苗载体的开发提供新的实验基础。