Mbd5基因敲除小鼠的癫痫分子发病机制研究

Epilepsy is a common chronic neurological disorder in children. Genetics is believed to have an important role in epilepsy. Extensive clinical evidence shows that MBD5 gene is highly associated with seizures in patients with MBD5 variation. MBD5 gene now is considered to be the candidate gene to epilepsy. However, the cellular and molecular pathogenesis associate with epilepsy in patients with MBD5 variation is still unknown. To gain insight into the mechanism we investigate the phenotype of seizures in Mbd5 gene knockout mice and conditional knockout mice, and analyze EEG feature by video EEG recording. We will also investigate the electrophysiological properties of mutant mice to confirm whether the excitatory or inhibitory neurotransmission changes are involved in the mechanism. To confirm if the numbers of synapses and post synapse receptors contribute to the change of neurotransmission, we will detect the GABAergic synapse by inmmunostaing. All the results will provide the theoretical basis for the molecular pathogenesis of MBD5 in Epilepsy.

癫痫是小儿神经系统常见的发作性疾病，遗传因素是其重要的病因。大量临床证据表明MBD5基因和癫痫高度相关，是其致病基因。但是MBD5基因在癫痫中的作用及机制尚不明确。MBD5和MeCP2基因同属MBD家族，都通过甲基化抑制下游基因转录。MeCP2基因缺陷导致其下游基因BDNF转录水平增高，抑制性突触传递减弱，神经元环路兴奋/抑制失衡，癫痫发作。鉴此本研究提出假设，MBD5通过MeCP2类似的通路介导癫痫的发生。研究将利用Mbd5基因小鼠敲除模型，和在此基础上构建的皮层兴奋性/抑制性神经元Mbd5基因条件敲除模型，通过观察各基因型小鼠自发性/声音诱导性癫痫发作表型和脑电特征、分析可能的下游基因BDNF的表达、膜片钳记录各基因型小鼠自发性及神经递质诱导性突触后电位的特征、免疫荧光比较抑制性突触及突触后受体数量的变化来验证假设。研究结果有助于揭示癫痫的分子发病机制，对临床具有重要的指导意义。

MBD5是近年来发现的神经系统疾病2q23.1缺失/重复综合征的致病基因。患者表现为严重的智力、语言、发育的障碍及癫痫，临床缺乏有效的药物治疗手段。目前对MBD5的功能及其表达异常与神经系统发育的关联知之甚少，阻碍了临床针对性治疗手段的研发，病人预后差，家庭及社会医疗负担重。因此本研究主要利用MBD5基因缺陷小鼠，一方面研究其癫痫相关的临床和电生理表现，另一方面研究MBD5基因对神经系统发育相关基因调控机制，为将来临床治疗靶点的转化研究提供理论基础。通过行为学及脑电生理研究，未发现MBD5基因杂合缺陷小鼠存在癫痫发作及临床下痫样放电的现象。膜片钳技术研究MBD5基因杂合缺陷小鼠体外胚胎细胞诱导的神经元细胞也未发现和癫痫相关的诱发电位，进一步证实MBD5基因杂合缺陷小鼠无癫痫相关临床表型。Mbd5-/-小鼠由于严重的发育畸形及出生后断奶期的致死性，在癫痫发作表型和电生理研究实施上存在局限性。利用RNAseq技术本项目对Mbd5-/-小鼠脑组织进行基因表达水平分析，发现多个调控细胞骨架及生殖细胞增殖的调控基因异常表达，尤其是和天使综合症及PWS综合症相关的印记基因表达的异常（Ube3a，Snurf，Peg3，Igf2）提示MBD5基因可能通过对早期神经系统发育相关基因的调控介导神经系统发育。在对上述异常转录基因的调控机制研究方面，通过转录不同MBD5isform的293T细胞及Mbd5-/-小鼠脑组织研究，发现MBD5基因具有调节细胞DNA甲基化的作用，但有趣的是选取RNAseq检测发现的异常表达基因作为目的基因，研究其转录起始点DNA甲基化水平，并没有发现MBD5基因缺陷导致目的基因转录起始部位甲基化异常，提示MBD5基因并不通过直接改变基因转录起始部位CpG岛的甲基化发挥转录调节作用。研究进一步对Mbd5-/-小鼠脑组织的组蛋白进行研究，发现代表着基因表达激活状态的H3K4Me3表达增加，而代表基因转录抑制状态的H3K27Me3水平却下降，提示MBD5基因可能通过组蛋白的甲基化修饰调控参与基因表达的调控。