基于特异性生物素标记的亚细胞空间蛋白质组学技术研究胰岛β细胞糖脂毒性的动态分子机制

Long-term exposure to free fatty acid and glucose can destroy the function of pancreatic beta-cell, termed as glucolipotoxicity, contributing to the occurrence and development of type 2 diabetes, so the study of its molecular mechanism could be very meaningful for the prevention of type 2 diabetes. Our previous study of dynamic total proteome of glucolipotoxicity in INS-1 cells indicated that subcellular localization of differentially expressed protein were highly specialized and dynamically changed during the progression of glucolipotoxicity. As we known, the subcellular compartmentalization of proteins act as the one of important mechanism to regulate their biological function. Therefore, we plan to analyze the quantitative subcellular proteome of mitochondria, endoplasmic reticulum and nucleus based on the proximity-dependent biotin labeling technique, construct their dynamic network models of protein subcellular localization, dig out the new glucolipotoxicity-related proteins and further investigate their molecular mechanism in the process of glucolipoxicity on the level of both cell-line and animal-model. We hope that this study would not only bring out more research interests to help the scientists reveal the mechanism of glucolipotoxicity in beta cells, but also offer the new potential drug targets of ameliorating the glucolipotoxicity for prevention of beta cells.

长时间高糖和高脂环境对beta细胞产生的糖脂毒性作用是2型糖尿病发生发展的重要原因，研究其分子机制对于防控糖尿病具有重要的指导意义。申请人前期项目开展的INS-1细胞糖脂毒性动态蛋白质组学的研究显示，差异表达的蛋白质在亚细胞定位上有明显的特异性和动态性。众所周知，蛋白质的亚细胞定位是其发挥特异性生物学功能的一种重要调控方式，所以本项目拟以此为切入点，利用活细胞空间特异性生物素标记方法分别对线粒体，内质网和细胞核定位的蛋白质进行系统的组学定量分析，通过构建蛋白质亚细胞定位动态变化的网络模型，挖掘与beta细胞糖脂毒性作用相关的关键蛋白分子，并在细胞和动物水平深入验证和研究其具体的分子机制。我们希望本项目的实施不仅可以为揭示beta细胞糖脂毒性作用机制提供新的研究思路，也可以为缓解beta细胞糖脂毒性作用提供新的潜在药物靶标。

长时间高糖和高脂环境对beta细胞产生的糖脂毒性作用是2型糖尿病发生发展的重要原因，研究其分子机制对于防控糖尿病具有重要的指导意义。蛋白质的亚细胞定位是其发挥特异性生物学功能的一种重要调控方式，申请人前期项目开展的INS-1细胞糖脂毒性动态蛋白质组学的研究显示，差异表达的蛋白质在亚细胞定位上有明显的特异性和动态性。本项目对参与糖脂毒性过程的蛋白分子DDX1，Setd8和Rhob，从其亚细胞定位变化的角度研究和阐述分子机制。我们已经发现1）高脂刺激对 DDX1 的表达量没有影响，但是高脂刺激能够促进 DDX1 进入细胞核和 Stress Granules。高脂抑制胰岛素翻译的分子机制是通过 DDX1 的磷酸化，导致其与翻译起始的相关蛋白从胰岛素 mRNA 上解离下来，从而抑制胰岛素的翻译；2）Setd8确实参与了高浓度葡萄糖促进INS-1细胞增殖的过程，其促进细胞增殖的作用并不依赖于经典的PI3K-AKT-mTOR通路和糖酵解-AMPK途径，而是与高糖环境的己糖胺代谢通路上调以及蛋白质的O-GlcNAc修饰过程有很大关系；3）RhoB的转录水平和蛋白水平均持续上调，和INS-1细胞的凋亡率变化趋势高度一致。过表达RhoB明显提高了INS-1细胞的凋亡率，并且随着PA刺激时间的延长，RhoB逐渐向细胞膜和高尔基体区域聚集，高尔基体逐渐呈现碎片化。当将影响RhoB亚细胞定位的C端189位、192位的棕榈酰基修饰位点以及193位的异戊烯基修饰位点进行突变发现，C192S和C193S突变后RhoB对高脂刺激不再敏感，说明高浓度游离脂肪酸一方面通过增强转录和翻译促进RhoB的表达，另一方面通过代谢中间产物修饰改变了RhoB的正常亚细胞定位，促进胰岛β细胞的凋亡过程。此外，我们还针对数据非依赖性质谱数据开发了针对性的分析流程DIA-MS2pep，实现了对修饰位点鉴定更加高效和准确的不依赖库的分析策略。