netrin-1与UNC5H4在颅内自我刺激促成年海马新生神经元存活中的作用及机制研究

探寻促进成年神经元再生及新生神经元存活的分子机制，一直是成年神经元再生修复领域的重要问题。申请者最近发现颅内自我刺激可有效促进成年啮齿类动物海马齿状回神经元再生和新生神经元存活，论文发表于Neuroscience。在前期研究中，我们进一步发现，上述颅内自我刺激可明显并特异地上调新鉴定的依赖性受体UNC5H4及其配体netrin-1的表达。本研究拟在此基础上，利用体外细胞模型、动物模型及相关分子生物学技术，检测颅内自我刺激后，UNC5H4、netrin-1在小鼠海马齿状回新生神经元中的原位表达，鉴定二者结合的结构域，探讨这一配、受体系统的神经生物学作用及可能活化的下游信号通路，进而阐明UNC5H4∕netrin-1受体系统对海马新生神经元存活的影响，探索利用行为治疗促进神经元再生修复及发挥神经元保护作用的新机理，为海马损伤的生物治疗提供有效靶点，进而拓展深化对依赖性受体生物学功能的认识。

探寻促进成年神经元再生及新生神经元存活的分子机制，一直是成年神经元生修复领域的重要问题。在本研究中我们首先建立了小鼠ICSS 模型，应用免疫组化法我们在ICSS处理1周、 2周和4周的小鼠海马新生神经元中分别检测出了netrin-1 与UNC5H4 的原位特异性表达，进一步的western blot检测及应用ELISA法进行的鼠脑海马区netrin-1 的浓度检测则从定量角度肯定了netrin-1在促进新生神经元存活过程中的高表达。我们运用生物信息学方法对UNC5H4 与 netrin-1 蛋白的结构域进行预测分析，进而构建并纯化了一系列的长度不同的包含不同结构域的 UNC5H4 与 netrin-1 的真核表达 载体。GST -pulldown 和免疫印迹分析都提示 UNC5H4 胞外段 Ig 功能域是与 netrin-1 结合的关键结合结构域。利用分离纯化培养的成年小鼠海马神经元模型,我们进一步研究发现过表达UNC5H4后细胞凋亡增加明显；在过表达UNC5H4后给细胞添加外源性netrin-1，与对照组相比较实验组中的细胞凋亡明显的减少，凋亡相关激酶DAPK、caspase-3的活性有明显的下降;在IMR-32细胞中，转染siRNA沉默内源性 netrin-1表达，或转染△UNC5H4-ECD后，细胞表现出凋亡率增高; 利用培养的UNC5H4+/+、UNC5H4-/- MEF细胞，在给予血清饥饿处理后及神经生长因子撤退处理后，两种细胞表现的存活能力存在明显的差异，UNC5H4+/+ MEF比UNC5H4-/- MEF细胞存活程度高；在给予不同浓度的netrin-1后，UNC5H4+/+ MEF细胞存活能力有所上升.体内试验则证实, 向海马区预注射UNC5H4中和抗体或重组△UNC5H4-ECD后，与对照组相比， ICSS 1周、2周及4周后，海马齿状回BrdU+细胞数与BrdU+/NeuN+细胞数明显减少.上述研究结果充分验证了我们提出的假说,即ICSS 可能通过活化UNC5H4/netrin-1通路，促进了成年小鼠海马新生神经元的存活。本研究为揭示了利用行为治疗促进神经元再生修复及发挥神经元保护作用的新机理，为海马损伤的生物治疗提供有效靶点，进而拓展深化对依赖性受体生物学功能的认识。....