GAPDH在益生菌黏附及对致病菌的黏附抑制中的功能机制研究

The adhesion of probiotics and pathogens is a prerequisite for their colonization and performing important physiological functions. At present, a special class of proteins with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as their representative is identified on the surface of probiotics and pathogens. This class of proteins does not have signal peptides and plays important roles inside the cell, so it is not able to study their extracellular functions by inactivating the genes encoding these proteins. This causes the extracellular function mechanism of these proteins unclear. To clarify the function of GAPDH in adherence of probiotics and probiotics against pathogens adhesion, the mutant strains and the strains overexpressing GAPDH are constructed. The gene encoding the cytosolic protein is added at the 3’ end of the gene encoding GAPDH, which can prevent its secretion and retain GAPDH in the cytoplasm, so it can create the viable mutant strain. In addition, the probiotics with poor adhesion and with no ability to prevent pathogen adhesion are used to express the gene encoding GAPDH. We ascertain the roles of the cell surface GAPDH by investigating the abilities of the mutant strain and GAPDH-overexpressing strain to prevent the pathogen adhesion.

黏附是益生菌和致病菌定植机体和发挥重要生理作用的前提。目前在益生菌和致病菌的表面发现了一类以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为代表的特殊蛋白质。由于这类蛋白质无信号肽且在细胞内发挥重要的生理功能，因此无法利用基因敲除、突变等手段研究其在胞外的功能，导致此类蛋白质在细胞外的功能机制尚不清楚。为了阐明GAPDH在益生菌黏附及抑制致病菌黏附中的功能，本课题利用基因融合和同源重组技术，在GAPDH的C端融合上细胞质蛋白质，阻止GAPDH的分泌，从而达到GAPDH的细胞质定位；另外在黏附性极差和无抑制致病菌黏附能力的益生菌中过表达GAPDH基因，通过检测GAPDH细胞质定位菌株和过表达菌株的细胞黏附能力和抑制致病菌黏附能力的变化来研究GAPDH在益生菌黏附及抑制致病菌黏附中所起的作用。

黏附是益生菌和致病菌定殖机体和发挥重要生理作用的前提，但是目前乳酸菌黏附机理仍然不是很清楚。在本项目中，我们首先通过大量查阅文献发现以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为代表的无信号蛋白质不仅存在于致病菌中，还广泛存在于益生菌表面，基于不同研究机构不同研究人员研究的不同菌株及其结果，我们发现在不同细菌中存在一个核心的非经典分泌蛋白质群，这类核心的共有的非经典分泌蛋白质我们称其为共有非经典分泌蛋白质（common non-classically secreted proteins），通过分析我们认为这些蛋白质不是由于细胞裂解，而是通过目前尚未知的途径被分泌到细胞外的。.我们分析发现体外自聚、共聚、疏水性三者之间不存很强的线性相关性，这表明三者可能反应菌株的不同表面特性，结合细胞实验，筛选出黏附性强的植物乳杆菌AR326和AR269及黏附性差的植物乳杆菌AR171和副干酪乳杆菌AR187。为了阻止GAPDH的分泌, 我们尝试利用含GAPDH的4种非经典分泌蛋白质分泌三种报告蛋白质。结果发现Nsp不能阻止这4种非经典分泌蛋白质分泌，PhoA阻止效果也不好。这两种报告蛋白质并不适合作为阻止GAPDH的报告蛋白质，但当我们把BgaB连接到上述4种非经典分泌蛋白质分泌后，BgaB能阻止包括GAPDH在内的三种非经典分泌蛋白质的分泌，因此BgaB可用于阻止GAPDH的分泌。但值得注意的是，一种非经典分泌蛋白质YvgN能引导BgaB的分泌表达，而细胞质蛋白质的分泌表达历来是一个难题，这可能为外源蛋白质的分泌表达提供了新的解决方案。当我们把融合基因转入到AR326或AR269后，插入BgaB的植物乳杆菌AR326或AR269黏附性能明显变弱，但一些生理特性发生变化。进一步，我们发现S层蛋白质在植物乳杆菌黏附中起着重要的作用，而且GAPDH是植物乳杆菌来源的S层蛋白质的主要组成成份，进一步我们通过在黏附强或者黏附性弱的乳酸菌体外添加GAPDH、GAPDH抗体等方式，发现GAPDH在其黏附中起着重要的作用。利用类似方法，研究发现GAPDH能抑制30%的致病性大肠杆菌黏附到细胞上。综上研究表明GAPDH在植物乳杆菌黏附和抑制致病菌黏附中起着重要的作用。