Durancin GL的生物合成及其靶向抑制李斯特菌的机理研究

Bacteriocins produced by food grade microorganisms are very effective to inhibit the growth of food-borne pathogens, which gain them special importance in improving food safety. Through previous study, the applicants isolated a bacteriocin-producing strain Enterococcus durans 41D from Hispanic cheese which inhibits the growth of Listeria monocytogenes. Plasmid curing, gene sequencing and bioinformatics analysis suggested the bacteriocin is novel, thus designated as Durancin GL. This project focuses on this bacteriocin, gene cloning and heterologous expression will be used to determine its biosynthesis genes; Fluorescent probes will be employed to detect the leakage of Listeria moncytogenes intracellular materials after exposure to Durancin GL; Alanine scanning will be used to determine the key amino acids in Durancin GL; To clarify the hypothesis that "Durancin GL targeted certain molecular of Mannose phosphotransferase system (Man-PTS) in Listeria to inhibit its growth", interactions between Durancin GL and Man-PTS of Listeria will be investigated. This project will unravel the biosynthesis genes of Durancin GL and illuminate the mechanism of how Durancin GL targeted Listeria to inhibit its growth. The results will not only provide new choices for developing high efficient natural food preservatives, but also provide in depth perception on how bacteriocins specially targeted certain microorganisms to inhibit their growth.

食品级微生物源细菌素对控制有害菌生长，提高食品安全质量具重要意义。通过前期研究，我们从西班牙干酪中分离到一株产细菌素的耐久肠球菌，通过质粒消除、基因测序及序列生物信息学分析确定该细菌素（Durancin GL）为一新型细菌素。本项目以Durancin GL为研究对象，采用基因克隆和外源表达对其生物合成基因进行确定；运用荧光探针检测李斯特菌被Durancin GL作用后其细胞内物质的泄漏情况；采用丙氨酸扫描技术确定Durancin GL的关键氨基酸位点，并对其与李斯特菌甘露糖磷酸转移酶系统（Man-PTS）相关分子的相互作用进行研究，推断"Durancin GL通过与李斯特菌Man-PTS中某一元件发生特异结合而实现对其靶向抑制"的假设的科学性。项目成果将明确Durancin GL的产生机制并探明其靶向抑菌机理，不仅为开发高效的天然食品防腐剂提供新选择，也为深入明确细菌素的作用提供科学依据。

食品级微生物源细菌素对控制有害菌生长，提高食品安全质量具重要意义。通过前期研究，我们从西班牙干酪中分离到一株产细菌素的耐久肠球菌，通过质粒消除、基因测序及序列生物信息学分析确定该细菌素（Durancin GL）为一新型细菌素。通过本项目的实施，证实细菌素Durancin GL的生物合成基因定位于质粒pDGL1上，测定出了pDGL1的全部基因序列（GENEBANK注册号为HQ696461），并证实了durAB基因簇可以决定细菌素Durancin GL的合成和免疫；实现了细菌素Durancin GL基于pET30a载体和pGEX-6P-1载体的大肠杆菌表达菌株Roseta（DE3）高效重组表达；研究揭示了李斯特菌经细菌素Durancin GL处理后，细胞内的ATP分子大量外泄，从而引起李斯特菌细胞内ATP能量水平的迅速下降进而导致菌体死亡；在牛乳中添加终浓度为256 AU/mL的细菌素Durancin GL时，不同的灭菌处理方式（高温杀菌，巴氏杀菌）不影响实验期间（15 d）细菌素Durancin GL抑菌活性的发挥；通过定点突变技术对Durancin GL进行丙氨酸扫描突变，研究结果显示，其中3个突变体（G07A，C10A，C15A）失活，10个突变体（N6A，E14A，W16A，D18A，E25A，G27A，I29A，N32A，G33A，G38A）活性表现出明显减弱，同时7个突变体（K12A，K21A，K24A，K28A，I30A，H37A，R43A）活性增强。抑菌谱方面，4个突变体（D18A，K21A，G27A，G38A）与野生Durancin GL相比表现出明显缩小，有4个突变体（K12A, Q13A, I30A, V31A）表现出抑菌谱扩大。本研究揭示了，在分子水平上，细菌素Durancin GL与李斯特菌表面受体通过关键氨基酸位点的结合，定位结合在李斯特菌细胞膜上，并打开其细胞膜通道，从而引起细胞水平上李斯特菌细胞内ATP分子大量外泄，李斯特菌因细胞内ATP能量水平的迅速下降进而导致菌体死亡。本研究成果为开发高效的天然食品防腐剂提供新选择，也为深入明确细菌素的作用提供科学依据。