基于转录组测序的美罗华治疗B淋巴细胞非霍奇金淋巴瘤耐药分子机制的研究

Monoclonal anti-CD20 antibody rituximab (RTX) has made significant progress in the treatment of B-cell non-Hodgkin 's lymphoma (NHL). However, RTX resistance remains a obstacle in the utilization of RTX, and the molecular mechanism of RTX resistance remains unclear. We have confirmed that the complement regulatory membrane protein CD59 plays an important role in RTX resistance. We have developed a CD59 inhibitor which can significantly reverse RTX resistance. Recently, we have detected the differences of gene expression between original and resistant cell lines using Transcriptome Sequencing and verified the results using immunohistochemical. We have got a lot of genes which expression trends are significantly different. The current study intends to systematically study the key signaling pathways of RTX resistance at molecular, cellular, animal and clinical samples level using immunohistochemistry, Western blot, FACS, Real-time PCR and funciton suppression and identify the key molecules of RTX resistance which influences the CHOP resistance either, as well as elucidate the molecular mechanisms underlying the interaction of key molecules and other molecules in RTX resistance. This project will throw light on the new therapeutics way of treatment of B-cell NHL.

单克隆抗CD20抗体美罗华（RTX）在治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）方面取得了重大的进展。然而，RTX耐药仍然是治疗的棘手问题，且其中的分子机制仍不甚明确。我们曾证实补体膜调控蛋白CD59在RTX耐药中发挥了重要作用，并研发了能明显逆转RTX耐药的CD59抑制剂。最近，我们利用转录组测序技术检测了原始与耐药细胞株基因的差异表达情况，并通过免疫组织化学技术对结果进行了初步的验证，获得了差异基因表达谱。本研究拟以转录组测序结果为基础，利用免疫组织化学、Western blot、流式细胞术、RT-PCR及功能抑制等方法，在分子、细胞、动物整体水平及临床样本系统深入的研究参与RTX耐药的关键信号通路，明确其中的关键分子节点及其潜在的在CHOP化疗耐药方面的作用，并阐明关键分子节点作用的具体分子机制，以期为NHL的治疗提供新思路与新策略。

单克隆抗CD20抗体美罗华（RTX）在治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）方面取得了重大的进展。RTX杀死B细胞恶性肿瘤的机制主要为补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity, CDC），抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）和直接促进凋亡（apoptosis）作用。大量的研究证据表明，CDC作用在RTX杀伤肿瘤细胞的过程中可能扮演着更为重要的角色。介导CDC作用的补体系统是先天性免疫的重要组成部分。然而，随着RTX应用的广泛与深入，RTX的原发与继发耐药现象越来越受到人们的关注，且其中的分子机制仍不甚明确。我们曾证实补体膜调控蛋白CD59在RTX耐药中发挥了重要作用，并研发了能明显逆转RTX耐药的CD59抑制剂。我们已经成功诱导制备了RTX耐药的B淋巴细胞NHL细胞株Ramos640与Raji32，并利用基于二代测序的转录组测序技术分别检测了原始Ramos细胞系与RTX耐药细胞株Ramos640的20049个基因的表达情况，对测序结果进行分析后获得了许多表达差异变化较明显的基因。进一步通过涵盖重要的肿瘤相关信号通路的131种蛋白的磷酸化抗体芯片（CSP100，Full Moon Biosystems Co. Ltd），检测了Ramos640相对于Ramos细胞显著变化的信号分子，发现在耐药Ramos细胞中上调和下调的多种信号分子与细胞凋亡密切相关，其上游受多个PKC超家族信号分子调控。我们首先证实了在Raji和Ramos两种耐药细胞株中多种PKC家族蛋白表达水平以及BCL-2磷酸化水平确实显著上调。进一步使用处于临床III期试验的PKC抑制剂Midostaurin处理原始与耐药细胞，发现该抑制剂可显著下调多种PKC家族蛋白水平，抑制BCL-2磷酸化，进一步证实PKC抑制剂Midostaurin体外使用时可显著逆转RTX的耐药。从而证实Burkitt淋巴瘤RTX耐药的关键分子节点就是PKC并阐述了其作用的具体分子机制。而PKC抑制剂Midostaurin可显著逆转Burkitt淋巴瘤对RTX的耐药，具有重要的应用前景。本研究为NHL的治疗提供了新思路与新策略，也为未来改善原有的NHL治疗方案提供了有价值的理论与实验依据。