肝郁证的影像遗传学与基因调控网络研究

Syndrome of Gan stagnation is closely related to liver's function of controlling dispersion .If it had functional disorder,the liver would performed for Liver-qi Invasion Syndrome and liver Qi stagnation. Our previous study found that gan stagnation is related to the Brain central nervous system. We will adopt BOLD-fMRI techniques to study the changes of different brain regions of normal volunteers and patients of stagnation in order to determine the location of brain area whose function changed. Through exon sequencing and high-throughput HiSeq sequencing revealed the predisposing genes of patients who have gan stagnation , Through MicroRNA sequencing found related miRNA in the patients'serum.Use electrochemical method and liquid phase protein chip technology to test CSF in order to find neuroendocrine changes. Then through the Macaque and mouse model and key gene knockout and overexpression in mice two models to verify the conclusion we study by patients, using BOLD-fMRI tecnology and cerebral localization instrument to verify the function change of brain areas.Adopt HE,Nissl staining methods to observe Histological changes of brain, using Immunohistochemistry, Western blotting and PCR technology to test expression changes of susceptibility gene .Eventually we could find out the relationship between gan stagnation and imaging genetics , gene regulatory net.

肝郁证与肝主疏泄功能密切相关，疏泄失常表现为肝气逆与肝气郁。我们前期的研究发现肝郁证的发病与脑中枢有关，我们拟采用脑部BOLD-fMRI成像技术，对正常志愿者和肝郁患者进行不同脑区功能变化定位研究，以确定肝郁证的功能改变脑区。通过外显子测序和高通量HiSeq测序发现肝郁患者的易感基因，MicroRNA测序发现患者血清中相关的miRNA,电化学法和液相蛋白芯片技术发现脑脊液神经内分泌变化。然后通过猕猴和小鼠肝郁模型及关键基因敲除和过表达小鼠两类模型来验证通过患者研究得出的结论，采用BOLD-fMRI成像和脑定位仪来验证功能改变脑区，HE、尼氏染色观察脑组织形态改变，采用免疫组化、免疫印迹和PCR技术来检测易感基因的表达变化，最终找到肝郁证与影像遗传学及基因调控网络的关系。

肝郁证是以情绪低落、心情抑郁为主要症状的病证，是肝病证候的核心。作为近几年的研究热点，其形成机制及证侯内涵至今尚不完全清楚。结合我们前期的研究发现肝郁证的发病与脑中枢有关，本项目是利用多组学、多层次、多平台开展的基于人、猴、鼠的肝郁证影像遗传学及基因调控网络研究。主要采用脑部BOLD-fMRI 成像技术以确定肝郁证患者及食蟹猴、啮齿类动物模型的功能改变脑区，并结合基因测序分析筛选肝郁证的易感基因，蛋白质组学分析神经内分泌及代谢产物变化，关键基因敲除小鼠深入验证。首先，我们联合多家医院招聘并筛选符合肝郁证辨证的病人及正常受试者，同时我们成功构建了2种食蟹猴肝郁模型，该模型能较好地模拟人类肝郁证状态，为本项目的研究奠定了模型基础。临床试验和食蟹猴肝郁模型脑成像分析结果，初步明确肝郁证相关脑区集中在前额叶、纹状体、枕叶及部分边缘系统（海马、扣带回）等。并初步构建了肝郁证相关miRNA-mRNA调控网络，为阐明其基因表达调控机制奠定基础。同时发现肝郁状态与色氨酸代谢（5-HT、IDO1）、炎症因子（MCP-1）、miR-378d/BDNF异常密切相关，推测MCP-1、IDO1、BDNF可能是其易感基因。最后我们应用CUMS方法成功制备了大鼠、小鼠肝郁模型，联合特异性抑制剂或基因敲除，结合以方测证方法，初步明确MCP-1、IDO1、BDNF是肝郁证的易感基因。同时阐明加味逍遥散可通过调节MCP-1、IDO1、BDNF等基因表达及其相关信号通路（如β-Arrestin2通路），改善有关脑区的异常功能活动，从而发挥治疗肝郁证的作用。本项目从多层次、多水平阐明肝郁证的发病基础及靶标基因调控机制，并为加味逍遥散治疗肝郁证提供现代分子生物作用基础，为肝郁证的本质研究提供了新的思路和途径。