TUBB3在癫痫中调节GABARAP介导GABA-A受体转运的机制研究

Hypersynchronous electrical discharge of neurons is the fundamental cause of epileptic seizure. The process that disease signal of the abnormal neurons quickly pass to a wide range of neurons is a key link in epilepsy, during which inhibitory synaptic transmission plays a significant role. Our previous studies have found that microtubule stability regulate synaptic transmission. Meanwhile, whole cell clamp recordings have revealed that increased amplitude of GABA-A receptor -mediated mIPSCs in TUBB3 downregulation rat, TUBB3 overexpression have the opposite effect; Immunofluorescence have shown that a large number of the TUBB3-positive cells were colocalized with GABA ergic neuron and gephyrin, a central player at inhibitory postsynapses; co-immunoprecipitation have detected interactions between TUBB3, GABA-ARβ2/3 and GABARAP in the hippocampus tissue of epileptic rats. Therefore, we speculated that TUBB3 may play an important role in the regulation of epileptic seizures via inhibitory synaptic transmission. However, the mechanisms underlying this phenomenon have largely remained elusive. Based on the established clinical resource consisting of 14,000 regular follow-up epilepsy patients, more than 300 brain tissues from epilepsy patients undergoing surgery and three epilepsy animal models, the purpose of this project is to explore the mechanism of TUBB3 participating in epilepsy by regulating GABA-A receptor trafficking mediated by GABARAP, and illuminate the role and possible mechanism of TUBB3 so as to search for new ideas and methods of prevention and treatment of epilepsy.

神经元高度同步化异常放电是癫痫产生的根本原因,将异常神经元的疾病信号快速传递到众多神经元是引发癫痫的关键环节，而抑制性突触传递在这个环节中起着重要作用。课题组前期发现微管动力学调控突触传递(已发表)；同时膜片钳发现沉默β微管蛋白Ⅲ（TUBB3）增加了微小抑制性突触后电流；荧光三标发现TUBB3与GABA能神经元和抑制性突触后标记物共表达；免疫共沉淀提示TUBB3、GABA-A受体和GABA受体相关蛋白（GABARAP）相互作用，故我们推测TUBB3可能通过调控抑制性突触传递影响了癫痫的发生发展，但具体机制不清楚。本项目利用课题组建立的由14000多例癫痫患者组成的临床资源库、300余例癫痫患者术后标本组成的脑库及3种动物模型来探索TUBB3是否通过与GABARAP 相互作用参与神经元中 GABA-A受体转运，阐明TUBB3在癫痫中的作用，并对其功能进行研究，为癫痫的防治提供新思想和新方法。

1.项目背景：依托课题组建立的由14000多例癫痫患者组成的临床资源库、收集的耐药性癫痫患者术后脑组织及癫痫遗传家系组成的遗传资源库，结合已被课题组前期研究所证实的微管动力学调控突触传递，阐明β微管蛋白Ⅲ（TUBB3）在癫痫中的作用，为癫痫的防治提供新思想和新方法。.2.主要研究内容：.1）研究中建立了慢性癫痫动物模型和耐药性癫痫患者术后脑组织组成的脑库，研究TUBB3及其相关指标STMN1对癫痫动物模型行为学的影响，分析了它们参与癫痫发生发展的可能机制。.2）利用课题组建立的癫痫遗传家系组成的遗传资源库，对全面性癫痫发作患者家族的癫痫相关基因测序，发现了与微管一起运动的神经元特异性运动蛋白KIF1A功能障碍参与了癫痫的发生发展。.3）利用膜片钳技术研究了TUBB3、KIF1A对神经元电活动的影响及可能的突触机制。.4）通过对癫痫患者一年的随访，比较了丙戊酸镁和丙戊酸钠单药治疗过程中的安全性、耐受性和有效性。.3.重要结果、关键数据和科学意义：.1）发现耐药性癫痫患者脑组织中TUBB3及其相关指标STMN1存在差异表达，过表达或抑制其功能对癫痫动物行为学有明显影响。.2）发现与微管一起运动的神经元特异性运动蛋白KIF1A中一个罕见的杂合突变(c.1190C>A，p.Ala397Asp)，参与了癫痫的发生及发展。.3）全细胞膜片钳记录等结果显示，在 TUBB3 表达下调的大鼠中，GABA-A 受体介导的微型抑制性突触后电流的幅度和 GABA-A 受体的表达增加。免疫共沉淀结果显示，TUBB3 与 GABA-A 受体相关蛋白相互作用。结果表明，TUBB3通过与GABARAP 相互作用参与神经元中 GABA-A受体转运，提示了治疗策略中一种新的分子机制。.4）对原代培养神经元的全细胞记录显示，突变体KIF1A增加了神经元的兴奋性突触传递，且这种罕见的突变导致癫痫样活动。证明KIF1A功能障碍参与了癫痫的发生发展。.5）同步研究还发现，丙戊酸镁组的保留率和总有效率分别为73.1%和70.2%，明显高于丙戊酸钠组的64.2%和47.2%。结果表明，丙戊酸镁治疗具有良好的安全性和耐受性，可有效改善癫痫发作控制。