细菌光调控基因表达元件的分子设计

Phycoerythrocyanin α-subunit (α-PEC) is highly photochromic under irradiation of 500 nm or 570 nm light, to yield two photo-states: P566 of maximal absorption at 566 nm, P507 of maximal absorption at 507 nm. We plan to screen RNA aptamers, which can selectively bind the photo-states of α-PEC, by use of Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment (SELEX). When the screened aptamers are ligated with the 5'UTR of mRNA of the target gene, the association or dissociation of mRNA of the target gene with ribosomes will be determined by the association or dissociation of the photo-states of alpha-PEC with the 5'UTR of mRNA of the target gene, which is photoregulated by the irradiation of 500 nm or 570 nm light. As a result, a new kind of photoregulator will be molecularly designed, which can control the expression of target genes by the lights that induce the photochromism of α-PEC. The new kind of photoregulators work at RNA level, together with the photoregulators at DNA level and at protein level, will more fully equip our molecular tools to engineer the regulations of cells. It is important for us to manipulate the biological processes via lights.

藻红蓝蛋白α-亚基（α-PEC）具有可逆光致变色，能产生两个结构不同的光稳态，P566（最大吸收在566 nm）和P507（最大吸收在507 nm）。本课题拟采用SELEX技术筛选可选择性结合α-PEC不同光稳态的RNA适配子，将筛选到的RNA适配子整合于靶基因mRNA的 5'UTR，通过光调控α-PEC不同光状态，导致α-PEC与靶基因mRNA的5'UTR可逆的结合或解离，进而影响核糖体与靶基因mRNA的结合，从而实现用光调控靶基因的表达。这些光调控分子元件在RNA水平上能光调控靶基因的表达，可以为光调控生命过程提供新的光调控分子元件，并与现有的一些在蛋白质功能水平和DNA转录水平的光调控分子元件一起，组成更加完善的生命活动分子操纵的工具库。该研究对人为光调控生命过程具有重要意义。

在国家自然科学基金的资助下，主要从事以下的研究。.（1）根据Genebank中的燕麦向光素基因序列，人工合成了向光素基因的LOV2结构域编码基因片段，AsLOV2（404-560）；并构建C450A突变基因， AsLOV2（404-560,C450A）；进一步，缺失C末端的Jα肽段，得到AsLOV2（404-521,C450A）。这三个基因片段克隆于表达载体pGEX-6p-1，在E.coli BL21 (DE3)中获得表达，利用亲和层析，纯化得到与GST融合的目标蛋白。三个纯化蛋白具有与文献一致的吸收光谱，表明三种蛋白可与FMN结合，表现出光活性。在荧光强度上，C450A突变蛋白的荧光强度是野生型的6-7倍。.（2）野生型的LOV2在光照条件下，450位的半胱氨酸会与激发态的FMN发生加成反应，降低FMN荧光量子产率，突变型缺少巯基，不能发生光化学反应，因此突变蛋白的荧光要强很多。基于这一原理，并考虑到Hg2+与S有很强的亲合力，希望在有Hg2+存在的条件下，LOV中的巯基与Hg2+结合而不与FMN发生加成反应，从而增强荧光，实现对Hg2+的荧光检测。但初步实验表明Hg2+不增强LOV2的荧光。我们又将LOV2半胱氨酸周围的一些氨基酸突变为半胱氨酸，希望蛋白中两个临近的巯基能与Hg2+比较强的结合，实现Hg2+响应的蛋白质荧光探针。我们做了大约10个位点的突变，均没实现我们的目的。以后准备通过随机突变，利用流式细胞仪筛选的办法，筛选Hg2+响应的荧光蛋白探针。.（3）我们还构建了AsLOV2（404-521,C450A）与Cytb562通过蛋白酶识别肽段连接的融合蛋白。希望在融合蛋白中，Cytb562淬灭LOV2的荧光，当蛋白酶加入后，切割识别位点，Cytb562与LOV2远离， LOV2荧光恢复，实现蛋白酶测活的目的。但实验结果没有达到我们的目的。.（4）我们研究了胆色素与不同结构DNA的相互作用，发现胆绿素能选择性的与平行结构的G-四链体结合，表现出明显的增色效应，并在740nm处产生新的吸收峰。根据Job plot曲线，胆绿素与G-四链体以1:1的比例结合，但二者的复合物没有荧光。以后需要进一步筛选其它结构的DNA，不仅能够与胆绿素结合，而且能够产生800nm左右的荧光，作为一种新的近红外荧光探针，用于活体荧光成像。