水稻假激酶OsLMPK6在抗病中的作用及其机理解析

OsMPK6（Oryza sativa Mitogen-activated Protein Kinase 6）acts as a central regulator in rice disease resistance response. Although pseudokinase OsLMPK6 shows the highest sequence similarity to OsMPK6, it lack conservation of the catalytic residues in the kinase core and is thought to be catalytically inactive. It has no report on its function and mechanism in rice resistance response. Our previous study showed OsLMPK6-overexpress enhanced resistance to Xoo, but we couldn’t get T1 positive plant of OsLMPK6-overexpress and –suppression, and guessed its expression was tightly controlled in rice, it has an importance unknown function. The project will clarify the function and mechanism of OsLMPK6 in rice resistance to bacterial blight; The catalytic activity of OsLMPK6 was determined by biochemical analysis, its key catalytic sites that changes OsLMPK6 function were analyzed, and it was revealed that the function of OsLMPK6 catalytic activity in its resistance to bacterial blight; We will carry out comparison and analysis of OsLMPK6 and OsMPK6 that they mediated resistance pathways and molecular interactions. The study will provide new ideas and theoretical basis for the development of rice new germplasms conferring broad-spectrum and high-level resistance.

水稻假激酶基因OsLMPK6与水稻抗病反应的中心调控者OsMPK6高度同源，但在保守的催化位点上存在变异，其在水稻抗病中的作用和作用机理尚未有报道。前期的研究表明超量表达OsLMPK6可显著增强水稻T0植株对白叶枯病抗性，但不能获得超量和抑制转基因植株的T1代阳性植株，推测改变OsLMPK6在水稻体内的表达造成严重后果。为此，本项目拟采用诱导超量表达系统明确OsLMPK6在抗白叶枯病中的作用及其介导的抗病机制；从生化方面研究确定OsLMPK6的激酶活性，分析OsLMPK6功能性关键位点的氨基酸改变对激酶活性的影响，揭示OsLMPK6激酶活性在其抗白叶枯病功能上的作用；进一步比较、分析OsLMPK6和OsMPK6介导的抗病反应途径及分子间的相互作用。本研究将为创制广谱、高效抗性的新种质提供新的思路和理论依据。

本项目从水稻中克隆了一个MAPK激酶家族中的假激酶OsLMPK6。超量表达OsLMPK6（Over-OsLMPK6）提高植株对白叶枯病的抗性，而抑制OsLMPK6（OsLMPK6-RNAi）的表达对植株的抗性没有影响。进一步分析表明其正向调控水稻茉莉酸抗病反应途径。更为重要的发现是：OsLMPK6主要功能是调控花粉和胚珠的形成与发育。OsLMPK6转基因植株中提高或抑制阳性花粉和胚珠的OsLMPK6表达量，导致花粉和胚珠形成与发育异常，以至于植株不能产生阳性后代，而阴性花粉和胚珠能正常授粉结实获得阴性后代。OsLMPK6在MAPK激酶家族中绝对保守的催化位点TEY变异为MEY，将M突变成T并构建超量表达载体Over-OsLMPK6M转化水稻，Over-OsLMPK6M转基因后代能正常获得阳性分离单株，表明M位点突变为T后不影响植株的花粉和胚珠的形成与发育，同时提高植株对白叶枯病的抗性。因此，M位点是OsLMPK6功能的关键位点。采用诱导启动子控制OsLMPK6的超量和抑制表达，结果相似，CRISP编辑敲除OsLMPK6未能获得转基因植株。原核表达OsLMPK6和OsMPK6蛋白，体外检测激酶活性表明OsLMPK6与OsMPK6相比，激酶活性显著下降。因此，进一步解析OsLMPK6调控植株花粉和胚珠的形成与发育的机理，有可能为创制新的水稻不育系提供物质基础。OsLMPK6的全长cDNA与水稻基因组比较表明其由6个外显子和5个内含子组成。比较测序表明其在籼稻和粳稻及不同的水稻品种中的序列完全一致。芯片分析表明OsLMPK6在所有水稻组织中组成型表达，仅在开花后7天的胚乳中表达量明显上升。水稻接种白叶枯菌株显著诱导OsLMPK6上升表达，表明OsLMPK6参与水稻抗病反应。分析OsLMPK6和OsMPK6在其他物种的存在情况，OsMPK6同源基因存在于所有双子叶和单子叶植物中，而OsLMPK6同源基因仅存在于大多数的单子叶植物和少部分的双子叶植物中，蛋白质序列保守性非常高，表明它功能上保守的。 分析OsLMPK6和OsMPK6的互作基因表明既有各自特异互作的基因，也有共同互作的基因。这与OsLMPK6仅能正向调控水稻茉莉酸途径抗病反应，OsMPK6能正调控和负调控水稻抗病反应是一致的。OsLMPK6和OsMPK6蛋白的亚细胞定位都能存在与细胞质和细胞核中也表明了这一点。