胞内转运参与膜结合转录因子AtCLB响应逆境胁迫的单分子研究

Transcription factors play important roles in regulating plant growth, development and stress response. Membrane-bound transcription factors (MTFs) undergo unique steps from membrane to nuclear which are not involved in the action of nuclear transcription factors. The intracellular transport of MTFs leads to additional complexity of regulation mechanism. However, due to the lack of high resolution imaging and analytic techniques, the mechanism of how membrane localization and intracellular transport regulate the function of membrane-bound transcription factors in living cell are still unclear and remains to be further investigated. Based on our previous studies, this project focuses on three aspects of research through using photo-activated fluorescent protein labeling, a variety of advanced imaging techniques and data analysis methods. First, we will analysis the distribution patterns and dynamic properties of AtCLB, as well as their oligomerization states in different membrane microdomains. Then we will study the mechanism of the dissociation and intracellular transport of the AtCLB under different environmental stress. Finally, we will further explore how AtCLB is translocated to the nucleus. This project intends to clarify the activation mechanism of AtCLB during stress response through studying the spatio-temporal dynamics of their subcellular localization and intracellular transport at single-molecular level. Taken together, the results of this study will provide new clues for understanding the regulatory schemes of plant stress response.

转录因子在调节植物生长发育和响应环境变化中发挥重要作用。膜结合转录因子需要从膜上释放然后进入细胞核行使功能，这一区别于典型转录因子的过程导致其活性调控机制更为复杂。由于缺乏高时空分辨率成像及分析技术，活细胞中膜上区域化结合/锚定和胞内转运如何参与调控膜结合转录因子功能的机制尚不明确。本项目拟在我们过去工作的基础上，综合运用光激活荧光蛋白标记、借助超分辨SIM等成像技术和数据分析方法，开展三方面研究：(1)分析膜结合转录因子AtCLB在膜上的锚定微区、运动特征、聚合状态；(2)探究不同条件下，膜结合转录因子AtCLB从膜上解离及胞内转运的机制；(3)解析膜结合转录因子AtCLB跨膜运输进入细胞核的调控机制。本项目拟通过对AtCLB亚细胞定位和胞内转运的时空动态进行单分子水平研究，阐明胞内转运参与调控膜结合转录因子功能的细胞生物学机制，为深入理解植物响应逆境胁迫的调控网络提供重要理论依据。

前人研究报道AtCLB负调控植物对盐胁迫的抗性，以及其与机械敏感离子通道协同作用，调控植物响应机械刺激。然而，对AtCLB蛋白进行实时活体动态分析的研究比较匮乏，且AtCLB响应盐胁迫的潜在机制尚不清楚。因此，本项目应用我们前期建立的全内反射荧光显微术，结合全内反射结构光照明显微术和蛋白质体外相分离重组等新的技术与方法，对AtCLB蛋白响应盐胁迫的动态过程和机制进行了研究。以拟南芥为材料，通过遗传转化，获得了荧光蛋白标记AtCLB的材料，高分辨率成像分析显示其定位在内质网膜上。更为重要的是，其聚集分布在内质网和质膜接触位点EPCS。在此基础上，分析了AtCLB蛋白功能域对其在EPCS位点上精准定位的影响。结果显示AtCLB的N端跨膜结构域，介导其定位在内质网膜。C2结构域介导了AtCLB在EPCS位点的富集。其次，利用Iimaris识别并追踪分析AtCLB单分子图像，在单分子水平生分析EPCS的动力学特征，结果显示AtCLB在盐胁迫应答过程中，其动力学特征及其与膜微域的相关性发生显著变化。此外，在盐胁迫作用下，AtCLB发生核迁移，进入细胞核内作为转录调控因子调控盐胁迫响应的下游基因，对植物逆境应答具有重要调控作用。有趣的是，我们的研究中还发现AtCLB在响应盐胁迫时，形成相分离结构。对其蛋白质结构的分析发现，其包含了相分离发生的关键结构域，固有混乱区域 (IDR) 和卷曲螺旋结构域 (Colied-coli)，从而形成ER膜依赖型的相分离液滴。这一项目取得的研究成果，为进一步阐明AtCLB盐胁迫响应调控的机理提供新的依据。