耐性微生物间群体感应与金属适应性的内在调控机制研究

Using functional microbes to assist phytoremediation is one of the key and useful strategies to rehabilitate heavy metal contaminated soil. Recently plenty research has been focused on applying microbial quorum sensing system into boosting crop yields, alleviating bacterial virulence to crops and other environmental studies. It has been reported that there might be inner-regulating relations between quorum sensing and microbial adaptive mechanism towards stress, but now it is still unclear how the inner relations between signal transport and adaptive mechanism of resistant bacteria is and unsure what role heavy metal plays within the relation. Based on previous research, we choose one Gram-negative quorum sensing model strain and one resistant bacterium (from same family) strain as research objects in this study to 1) investigate the major quorum sensing system of Gram-negative resistant bacterium under different growth stage; 2) research the effect of cadmium and lead to quorum sensing system of resistant bacterium; 3) study the regulation of different types and concentration of microbial signals on expression of adaptive related genes. The result of this study may uncover the connection of microbial quorum sensing and adaptive mechanism and provide a theoretical foundation for new ideas in bioremediation of heavy metal contaminated soil.

微生物辅助植物修复重金属污染土壤是目前环境修复领域的关键技术之一，近年来利用信号分子介导微生物群体感应应用于农业和环境领域备受关注，有研究表明群体感应系统与微生物适应性机制可能存在内在调控关系，目前对于耐性菌信号传递与适应性机制的内在联系及重金属对该调控关系的影响作用机制尚未明晰。本研究拟在前期研究的基础上，选取同科革兰氏阴性模式菌与耐性菌作为研究对象，以镉铅为影响因子，通过分析化学、转录组与代谢组学手段，研究不同生长时期下革兰氏阴性耐性菌的主要群体感应系统和信号分子类型，明晰镉铅对该群体感应系统的影响作用机制，并阐明不同类型及浓度的信号分子对适应性基因表达的调控作用机制。研究结果有助于揭示微生物群体感应与适应性机制的内在联系，可为土壤重金属污染植物-微生物联合稳定修复提供新思路和理论依据。

随着工业化和城市化发展，重金属污染土壤修复已成为国家土地资源保障的重大需求，目前，微生物辅助其他修复技术成为当前技术优化重要趋势。本项目将重金属耐性菌群体感应体系和其胁迫响应机制联系起来，以革兰氏阴性菌Chromobacterium violaceum和Pseudomonas fluorescens作为研究对象。通过构建可同步检测9种群体感应AHLs信号分子的UPLC-MS/MS方法，优化前处理方法；以镉铅为胁迫条件，探究对比不同胁迫水平下胞外信号赋存状态、功能菌生长情况以及信号分泌情况；探究在不同镉铅复合胁迫水平下耐性菌群体感应与重金属适应性基因表达情况。本研究可为微生物生理调控机制研究进行理论补充，为优化微生物修复重金属污染提供新思路。本项目主要研究内容和科研结果如下：.1) 革兰氏阴性菌AHL类信号LC-MS/MS检测方法建立及前处理优化。利用液质联用技术，建立培养基为基质的多种AHLs同步检测法，回收率在60%-110%间， RSD均<20%，标准曲线R2>0.98，检出限为0.1~5 μg·L-1，定量限为0.3~16.7 μg·L-1。.2) 多金属耐性菌体外信号分子对镉铅胁迫的响应。研究表明中水平复合胁迫下，CV菌紫色素合成开始受到抑制，但CV菌对单一金属耐性强于PF菌；对于两种菌，镉铅复合添加的胁迫效应均小于单一金属胁迫。培养基环境下，C10-HSL和OC10-HSL均存在自然降解现象，镉铅复合胁迫可加速信号猝灭。CV菌信号分泌对胁迫存在“低促高抑”响应，PF菌信号分泌在不同胁迫下无明显差异。.3) 不同镉铅胁迫水平对CV菌群感与多金属耐性基因表达的影响。研究表明表明，低水平胁迫下，CV菌主要通过金属外排、转运阻隔和增强氧化还原酶活性来缓解重金属胁迫。中水平胁迫下基因表达差异量增大，主要与转录过程相关，推测CV菌以部分基础功能为代价，加速氨基酸合成，使金属与蛋白质螯合钝化。此外，在胁迫下群感信号合成酶基因CviI表达下调，导致信号分泌减少，细菌通过上调受体蛋白合成基因CviR表达，试图复苏，但该群感系统介导调控的VioB合成基因表达仍显著下调。.本项目结果总共发表SCI收录论文3篇，项目负责人参与国际学术会议，获得最佳口头报告奖。