马齿苋酰胺类生物碱标准化提取物和马齿苋酰胺E体内抗老年性痴呆活性研究

研究马齿苋酰胺类生物碱标准化提取物和马齿苋酰胺E的体内抗老年性痴呆活性。在前期对马齿苋化学成分进行系统研究及体外抗氧化和神经元保护活性筛选的基础上，本课题将（1）制备马齿苋酰胺类生物碱标准化提取物并建立其质量控制标准；(2)构建D-半乳糖致脑老化衰老小鼠AD模型，通过测定脑超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、MDA、Na+,K+-ATP酶、胆碱乙酰转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性及乙酰胆碱水平；HE染色观察脑组织形态学变化；原位TUNEL法检测细胞凋亡，免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白表达；水迷宫实验记录小鼠学习和记忆能力；从生化、组织和行为学三个方面研究马齿苋酰胺类生物碱标准化提取物及其活性单体马齿苋酰胺E的体内抗老年性痴呆作用。本课题研究结果将进一步揭示马齿苋抗老年性痴呆作用的药效物质基础；并为研制防治老年性痴呆的创新药物奠定基础。

1.马齿苋酰胺A-G等属于酚性生物碱，是马齿苋药材中的一大类特征性成分，在富集马齿苋酚性酰胺生物碱之前，本课题对马齿苋药材总多酚的含量测定方法进行了研究，考察了马齿苋药材总多酚的含量限度；利用HPLC-DAD-MS/MS定性检测到12个酰胺生物碱，根据MS/MS裂解规律，对其结构进行了初步解析，其中8个为新酰胺生物碱，命名为马齿苋酰胺H-O，4个为已知化合物马齿苋酰胺A-D。建立了马齿苋药材中酰胺生物碱的HPLC指纹图谱；建立了马齿苋酰胺A和马齿苋酰胺B的HPLC含量测定方法；对11个产地的马齿苋药材中马齿苋酰胺A和马齿苋酰胺B以及总酰胺生物碱的含量进行了测定。.2.利用正交实验法等对马齿苋总酚性酰胺生物碱提取物的制备工艺进行了考察，并优化了其纯化工艺。确定最佳制备工艺为：马齿苋药材用6倍量60%乙醇回流提取，提取3次、每次1h； 提取液合并后减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml，取上清液适量，加于2倍体积的HPD700树脂上，先用4.5BV的水冲洗，再用4.5BV 50%的乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩后干燥，即得。利用比色法测定了一批酰胺生物碱标准化提取物的总多酚含量，利用HPLC方法测定了提取物中马齿苋酰胺A、马齿苋酰胺B以及总酰胺生物碱的含量。.3.马齿苋酰胺生物碱标准化提取物灌胃可提高腹腔注射D-半乳糖/亚硝酸钠诱导的老年痴呆模型小鼠的学习和空间记忆能力。其机制与缓解D-半乳糖/亚硝酸钠引起肌体的氧化应激，使SOD代偿性增高恢复至正常水平、提高血浆CAT水平、降低血脑中脂质过氧化物MDA有关，高剂量组的作用强于低剂量组；此外，HE染色结果表明马齿苋酰胺生物碱提取物高低剂量均可减少D-gal/NaNO2引起脑海马CA3、CA4 和CA1区神经细胞核固缩或溶解、碎裂，胞浆出现浓缩红染的现象，对神经细胞具有保护作用。.4.马齿苋酰胺E高、低剂量组灌胃均可显著提高D-半乳糖/亚硝酸钠腹腔注射诱导的老年痴呆小鼠的存活率，马齿苋酰胺E高剂量组可显著提高老年痴呆小鼠的空间记忆能力，其机制与缓解D-半乳糖/亚硝酸钠引起的氧化应激，使脑组织中TOC, SOD, GSH代偿性升高恢复至正常水平有关，此外，还与促进海马神经元中抗凋亡蛋白Bcl-2表达、抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase 3表达，从而抑制海马神经元凋亡有关。