Tn917转座子介导的益生菌Lactobacillus casei LV355免疫调节相关基因的遗传筛选

免疫调节是干酪乳杆菌重要的益生特性。本申请拟通过转座子Tn917介导构建我们前期研究中发现的免疫调节株（Lactobacillus casei LV355）的突变体库，以细胞组分刺激小鼠骨髓源树突状细胞（BMDC）表达IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的水平为指标建立模型，筛选细胞因子诱生水平和模式显著变异的突变菌株。应用不对称PCR方法扩增Tn917插入位点的上下游序列，并与干酪乳杆菌全基因组序列比对分析，探寻免疫调节相关的功能基因。根据筛选到的突变基因设计引物，应用PCR方法分析这些基因在其它野生型干酪乳杆菌分离株中的分布规律和序列差异，阐述干酪乳杆菌免疫调节株的分子特征。本研究不仅为阐明Lactobacillus casei LV355对宿主免疫细胞调节作用的分子机制提供新的思路和数据信息，还将有助于发现干酪乳杆菌免疫调节株特异性的分子靶标。

免疫调节是干酪乳杆菌重要的益生特性。已有的研究表明益生菌及其细胞组分与肠道黏膜系统的免疫细胞相互作用诱发细胞因子释放量和释放模式的改变是其调节免疫的最显著方面，但是对其分子机制尚缺少理解。本项目建立和优化了干酪乳杆菌的转化技术，成功构建了1个干酪乳杆菌L. casei LV355的突变体库，并优化了体外刺激小鼠骨髓源树突状细胞（BMDC）、巨噬细胞、脾细胞以及肠上皮细胞系IEC-6释放细胞因子IL-6，IL-10，IL-12和TNF-α的作用条件，建立以细胞因子释放产量为评价指标的筛选模型。通过模型筛选成功获得了6株突变株，其诱导BMDC产生IL-12的量显著低于亲代菌株（p<0.01）。建立并优化了热不对称交错PCR方法，对突变体中的Tn917插入位点侧翼序列进行分析，发现了6个与酪乳杆菌L. casei LV355免疫调节相关的功能基因，为进一步揭示益生菌免疫调节中的功能分子及其机制奠定了基础。研究还建立了干酪乳杆菌与体外细胞相互作用模型，通过测定乳酸菌分离株的体外细胞粘附指数、脾细胞刺激增殖指数以及IL-12诱生量建立乳酸菌的体外免疫调节评价指标，并测定了不同菌株灌胃小鼠后的免疫调节效应，结果显示体外脾细胞刺激增殖指数（SI）和脾脏指数和胸腺指数有正相关趋势，而体外IL-12诱导量与灌胃21d的小鼠血清IL-12和血清IFN-γ含量呈显著正相关，表明建立的体外细胞模型对实验小鼠免疫调节能力具表征意义。项目执行期间开展了大量的干酪乳杆菌的分离与筛选工作，从江苏如皋、南通、扬州、淮阴等地的火腿、酸奶、奶酪、乳酸菌饮品、泡菜、发酵豆腐等食物样品中分离得到700余株乳酸菌菌株，应用REP-PCR 分子指纹图谱技术对菌株进行分类后，选取不同指纹图谱的代表株进行16SrDNA 测序鉴定，结果获得了44 株干酪乳杆菌分离株。通过筛选获得了具有较强耐胆盐、胆酸能力，并具有良好免疫调节功能特性的乳酸菌菌株9株，其中2株已被用于新型发酵乳产品的研发。研究成果“益生菌及其发酵乳加工关键技术及产业化” 获2011年江苏省科技进步二等奖。