绿豆抗豆象Br基因的克隆及功能验证

Bruchid (Callosobruchus chinensis) is one of the serious insect pests to mungbean (Vigna radiata) and other pulse crops. 6089A, derived from a wild mungbean TC1966 and V1973A, is highly resistant to bruchid, which is mainly controled by Br gene in TC1966. After introduced from AVRDC(Asian Vegetable Research and Development Center), we developed NIL population from 6089A and V1973A based on Br gene in previous work. And sequenced the resistant and susceptatble lines using Miseq technoligy, followed by SNP calling, then mapped Br onto a region of 300kb on chromosome 5 of mungbean genome. As the mapping region is not so fine and the assembly of mungbean reference genome need to be improved. In the present study, we will combine bioinformatics and molecular technology to fill the gaps within the target region, by comparative mapping between mungbean, common bean and other legumes. Then amplify and analyze the diferrent sequences within the target region between resistant and susceptatble lines, after identify the candidate gene, transgenic technology will be used for its fucntion validation. The results will be not only beneficial to further know how the gene works and design new strategy for genetic improvement of mungbean, but helpful for digging other bruchid resisatant genes in pyramiding breeding.

绿豆象严重危害绿豆、小豆等豆类生产和仓储。发掘抗性基因，培育抗性品种是遗传改良的主要目标之一。野生绿豆TC1966高抗豆象由显性主效基因Br（Bruchid resistant）控制。6089A是TC1966衍生的高抗绿豆栽培种，遗传背景与V1973A近似。课题组从国外引进6089A后，继续与V1973A杂交，通过分离后代单株自交繁殖等，构建了基于Br基因的近等基因系，然后分别选择不同的高抗、高感单株做Miseq测序分析及SNP发掘，最终将Br定位在绿豆第五染色体300kb区段。鉴于定位区间相对较大，且绿豆参考基因组组装不完善，本项目拟用比较基因组学结合分子标记验证等，逐步填平目标区段的gap，完善Br基因的精细定位；并进一步扩增、测序分析抗感基因池目标区段内序列差异等，筛选Br候选基因并做转基因功能验证及机理解析。研究结果将为深入探讨抗豆象Br基因的调控方式、开展分子修饰育育种奠定基础。

豆象严重危害绿豆等食用豆类的生产和仓储，开展抗性基因的定位及机理分析，既有助于抗性品种的培育，也有助于开发生物防治药剂等。项目通过绿豆NIL群体的构建及后代各家系的接虫鉴定，分别选取28个高抗家系和24个高感家系，构建了抗感池，并利用第二代测序技术进行了抗感池测序及SNP的发掘。考虑到抗豆象基因来源于野生种，而参考基因组是栽培种，因此，首先对SNP 进行了过滤，只有抗池有感池无的SNP保留，并对这些SNP在基因组的分布频率确定了抗豆象基因所在区段，并通过区段内标记开发，在其他后代材料中进行了验证。通过基因注释，进一步在目标区段内筛选到12个候选基因，分布在不同染色体区段，其中两个编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP可能与抗豆象特性相关。同时，开展了绿豆组织培养及再生体系、转基因体系研究，成功获得转基因阳性苗，但后代结果还需要进一步接虫验证。然而项目对抗感池种子中的PGIP蛋白进行的质谱分析发现抗感家系存在明显差异，从侧面说明该蛋白可能与抗豆象有关；为了寻求替代人工接虫鉴定的方法，采用全基因合成全长方法合成 VrPGIP1和VrPGIP2两个基因后，连入T载体；获得的重组质粒经过 PCR，扩增后克隆转入gateway 表达载体和农杆菌感受态，然后转入到烟草叶片进行了重组蛋白表达与纯化，构建了快速检测抗豆象蛋白的生物学方法。在上述研究工作的基础上，创新高抗豆象种质12份，其中有两份种质在新疆昌吉、大同天镇、张家口阳原等地表现良好，将进一步示范推广。本项目尚未完成在转基因层面的基因功能验证，但对候选基因的发掘及相关代谢组分析，对于进一步探讨抗性基因的作用机理奠定了基础。