蜂毒素诱导肝癌细胞自噬相关性细胞死亡的作用机制研究

Autophagy is highly conservative process of life evolution, and it generally exists in eukaryotic cells. Autophagy is closely related to cell survival. Anticancer medicines which could target autophagy may become the new ones for therapeutic of cancer strategic treatment. It is a important drug development means to derive antitumor active ingredient from biological toxin for screening of natural medicine. This is also one of the ways of practice the theory of traditional Chinese medicine on cancer treatment. A systematic and depth study on melittin anti-liver cancer function was made in our department for many years. Our studies，both in vivo and in vitro，demonstrated that melittin could multi-channeling、multi-targeting inhibit HCC cell line on proliferation and induce apoptosis. By electron microscopy and confocal laser immunofluorescence on our re-preliminary experiments, we had observed that melittin could induce autophagy in human HCC cell line, and it could also induce autophagy marker protein Beclin 1, LC3-Ⅱoverexpression. All the initially results confirmed that autophagy is also one of the tumor suppressor multi-targets of melittin. Thus,in this project,we intends to observe melittin-induced autophagyin human hepatoma cell HepG2 and SMMC-7721 and analyse the mechanisms of autophagy in cell death, and we also focus on the autophagy-related signaling pathway AMPK, PI3K / Akt and RAS / MERK to explore targets melittin on human hepatocellular carcinoma HepG2, SMMC-7721 autophagic cell death. All the above experimental researches will help us do development and utilization of melittin.

自噬是真核细胞中高度进化保守的生命过程，与细胞存活密切相关，将其作为抗肿瘤药物作用靶点是近年来肿瘤治疗热点研究方向之一。从生物毒素中提取抗肿瘤有效成分是药物研发的重要手段，是中医以毒攻毒理论治疗肿瘤的具体实践。多年来，我们对蜂毒素抗肝癌作用系列研究表明，其能多通路、多靶点抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡，近期又观察到蜂毒素能明显诱导人肝癌细胞自噬体形成，诱导自噬标记蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ高表达，初步证实自噬也是蜂毒素抑癌作用的靶点之一。本项目拟在前期研究的基础上，深入探讨蜂毒素诱导人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721自噬的效应和作用机制，基于Beclin 1复合物及自噬相关信号通路PI3K/Akt与RAS/MERK，明确蜂毒素诱导肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721自噬的作用靶点，阐明诱导自噬在人肝癌细胞死亡中的作用，为蜂毒素的应用打下基础。

自噬是普遍存在于真核细胞中高度进化保守的生命过程，与细胞存活密切相关，将其作为抗肿瘤药物作用靶点是近年来肿瘤治疗热点研究方向之一。自噬对肿瘤细胞的存活的作用具有双面性：一方面，适度自噬能促进肿瘤细胞存活；另一方面，过度自噬可使肿瘤细胞发生自噬相关性细胞死亡。相关研究还表明，抗肿瘤药物能引起肿瘤细胞产生保护性自噬机制，其与肿瘤细胞的耐药相关。蜂毒素（Melittin，Mel）能多通路、多靶点抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡。前期预实验通过电镜、激光共聚焦及免疫荧光技术，观察到Mel能明显诱导人肝癌细胞自噬体形成，诱导自噬标记蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ高表达，证实Mel可诱导人肝癌细胞自噬发生。本课题以人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2为研究对象，并建立了肝癌细胞荷瘤鼠模型，在体、内外研究蜂毒素对人肝癌细胞自噬的诱导作用，并分别通过激活和抑制自噬观察蜂毒素对人肝癌细胞增殖、凋亡、细胞死亡的作用，明确自噬在蜂毒素诱导人肝癌细胞死亡中的作用和地位。通过对自噬、凋亡相关通路蛋白的检测，探讨蜂毒素诱导人肝癌细胞死亡可能的相关作用机制。经研究发现：1、Mel能抑制人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞增殖、诱导凋亡、增强细胞死亡，同时Mel能诱导人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞自噬的发生。2、抑制自噬可增强Mel对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞增殖抑制、诱导凋亡、诱导细胞死亡的作用——Mel诱导人肝癌细胞产生保护性自噬反应。3、抑制自噬可增强Mel对人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用，其机制可能为抑制Beclin1复合物系统、下调Bcl-2的表达、促进人肝癌细胞CytC的释放进而激活线粒体凋亡通路相关。此为以后蜂毒素的抗肿瘤临床研究提供理论基础和设计思路。