胶质瘤干细胞的特异性核酸适体筛选及其在胶质瘤靶向药物治疗中的应用

Glioma is the most common and most lethal form of brain tumor in human. Recent data indicate that glioma stem cells are responsible for resistance of glioblastomas to radiotherapy and chemotherapy, thereby contributing to the poor survival of these patients.The development of a targeted therapy system specifically against glioma stem cells would significantly improve treatment efficiency. Using glioma stem cell as target, this project will apply in vitro selection techique to discover aptamer sequences that bind to glioma stem cells with high affinity and high specificity;optimal atpamers sequences will then be obtained via the combination of binding thermodynamic simulation and the nucleic acid synthesis method；using protein mass spectroscopy glioma stem biomarker on cell surface will be discovered and characterized； finally the aptamer will be used as a carrier for targeted drug delivery against glioma. The study from a new angle of chemical biology will establish a new method for indentifying biomarker for glioma stem cells, provide theory evidence and material foundation of elaborating the mechanisms of development of glioma and targeted therapies and innovative drug development.

胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见而又最难治疗的恶性肿瘤。最近的研究表明，胶质瘤干细胞的存在和胶质母细胞瘤的放疗和化疗抵抗相关，导致患者预后不良。针对胶质瘤干细胞的靶向给药系统治疗有望从根本上提高胶质瘤的治疗效率。本研究拟以胶质瘤干细胞为靶标通过体外筛选技术获得高亲和力和高特异性识别胶质瘤干细胞的核酸适体学列；结合热力学计算手段和核酸合成方法，对所获序列进行测序和结构优化，获得最优优序列；通过蛋白质质谱技术发现和表征胶质瘤干细胞表面特征生物标记物；并且建立以核酸适体为载体以胶质瘤干细胞为靶点的新型胶质瘤靶向药物治疗方法。本项目从化学和化学生物学的新角度出发，获得胶质瘤干细胞特异性识别分子和胶质瘤干细胞生物标志物，开发胶质瘤干细胞靶向给药体系，为揭示胶质瘤的发生与发展机制及靶向治疗和创新性药物的开发提供理论依据与物质基础.

肿瘤干细胞这一概念始于20世纪50年代末60年代初，随后逐渐得到一些学者的关注，认为它是肿瘤中具有无限增殖，并能产生分化的肿瘤细胞的一群细胞。胶质瘤干细胞的成功分离与发现，以及对其特性的初步揭示不仅仅为研究胶质瘤的发生、发展机理提供了新的线索，而且为治愈胶质瘤提供了可能。目前为止尚未发现一个属于胶质瘤干细胞真正特异的标志物，因此，如何找到它对我们来说仍然充满着挑战。. 核酸适体，是运用体外进化方法－SELEX技术筛选获得的，具有对靶标特异性识别的一种核酸序列，能够与细胞、有机分子、蛋白质、无机离子、生物大分子等广泛的靶标结合。肿瘤细胞与正常细胞在分子水平的差异性，为核酸适体能够对肿瘤进行分子成像、早期诊断和靶向药物传递与治疗提供了可能。. 本实验采用胶质瘤干细胞作为正筛细胞，以胶质瘤细胞U87为反筛选细胞，基于Cell-SELEX筛选技术，最终经过20轮筛选，得到5条能与胶质瘤干细胞相结合，具有亲和力高、特异性强的核酸适体。这些核酸适体中，W5对靶细胞的亲和力及特异性均为最佳，其Kd值为4.9±1.4 nM。通过对核酸适体W5序列上进一步的优化，得到优化后序列长度为66个碱基数的核酸适体W5-7，它与胶质瘤干细胞结合能力及特异性同W5相似，所测定的Kd值为4.4±1.1 nM。进一步对这条核酸适体在不同温度条件下与靶细胞的结合力的考察发现，适体W5-7不但可以在4oC条件下与胶质瘤干细胞结合，而且在生理温度（37oC）条件下，同样具有识别胶质瘤干细胞的能力。实验结果一定程度上表明，核酸适体W5-7所结合的位点可能为胶质瘤干细胞表面的某种膜蛋白。同时，与CD133表达阳性的胶质瘤干细胞能够被核酸适体W5-7所识别，而两者在胶质瘤干细胞上的结合位点并不相同。以上这些提示所得到胶质瘤干细胞的核酸适体具有特异性以及高亲和力，可以区分胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞及其他组织来源的肿瘤细胞；核酸适体W5-7可以替代CD133抗体来鉴定和分选胶质瘤干细胞，并用以甄定出胶质瘤干细胞的特异性标记物；将对实现从胶质瘤源头上的精准诊疗，提高整体疗效等方面具有重要的临床意义。