修饰SP-B a-helix 改善ALI时SP功能的研究

Surfactant protein B（SP-B） produced by alveolar to lower the surface tension by inserting lipids into the air/liquid interface of the lung is unambiguously necessary for adult pulmonary function. The hydrophobicity of the N-terminal segment assists insertion of the peptide into lipid, the amphipathic helix optimizes the orientation and charge specificity for interaction with specific lipids inbilayer-monolayer ensembles. The relation between SP-B a-helix and lipid in acute lung injury (ALI) was researched by methods of membrane molecular biology, the change of structure and function of SP-B a-helix is helpful to understand the molecular mechanism of ALI, and the maintenance and reparation of surface activity of SP-B was determined. From the informations of orientation, structure and function of SP-B a-helix affected by the environment of ALI, the key hydrophobicity amino acids or structure was analyzed. Through the reseach, determinate evolutionary SP-B mutation which is more suitable to maintain and repair the pulmonary function, can be used for replacement therapy of acute lung injury. It is very important to drug design of analogue and replacement therapy for acute lung injury.

急性肺损伤(ALI)是创伤的常见后果和致死性并发症之一。ALI过程中肺表面活性蛋白(SP)-B a-helix的结构、构象及功能有不同程度的改变，其影响着SP功能的维持，在肺损伤过程中有重要的作用。 本项目拟采用膜分子生物学的理论技术方法，研究ALI过程中微生化环境变化对SP-B a-helix在脂质中的构象及功能的影响，明确ALI过程中SP-B a-helix疏水结构域与脂质结构关系变化规律、维持和修复肺泡形态的疏水结构域的分子基础与机制，确定有助于维持和修复ALI肺泡正常功能的SP-B a-helix疏水结构域的结构特征；并以此为基础通过对SP-B a-helix进行分子定向进化设计，使其更有助于肺泡功能的维持和修复。 此项目研究成果有助于深入理解SP-B在ALI过程中的分子机理，并为急性肺损伤治疗提供新的理论依据和手段，为其替补治疗和基于结构类似物的药物设计开发奠定基础。

背景：急性肺损伤（ALI）是常见危重病，死亡率极高，特别是在发生急性肺损伤后肺水肿形成过程中，SP-B结构与脂质的关系变化与其病理生理密切相关。.主要内容：本研究利用肺冲击伤ALI动物模型和培养细胞损伤模型，观察了PS在伤后肺泡张力、气液界面稳定、通气和换气功能中的作用，以及肺损伤后SP-A和SP-B的表达变化特点、对SP-B a-helix疏水结构域构象和功能的影响等。对SP-B a-helix进行了分子定向进化设计，实现了载体表达，实现了SP-B 的初步改造和功能评估。.结果与结论：（1）阐述了SP在ALI中的作用与意义：在ALI动物和细胞模型中，PS在伤后肺泡张力恢复、维持气液界面稳定、通气和换气功能等具有重要作用；在重度ALI中，SP-A表达量是先降后升，SP-B则是先升后降；但mRNA表达量与蛋白表达趋势截然相反。（2）揭示了ALI中SP-B 与磷脂作用、疏水结构域的构象变化与表面活性作用功能：ALI时SP-B在肺泡膜上的含量明显减少；SP-B在膜中的构象受到较大影响；拉曼光谱结果显示SP-B通过其疏水性作用和膜结合能力，改变磷脂双分子层中C-C骨架的构象，减轻LPS等对细胞造成的损伤。（3）设计出改善SP-B a-helix疏水结构域构象和功能的疏水结构域序列，探讨了SP-B a-helix疏水结构域构象、功能变化的ALI分子机理：基于SP-B a-Helix结构、疏水性以及正电荷分布设计并筛选出KAAVV模拟肽；结果显示KAAVV制剂能够明显的降低气液表面张力，KAAVV对DPPC与DPPG的C-C骨架、C-H骨架、C-N骨架的构象都产生了影响，可使磷脂侧链间的有序性增强，双分子层膜的流动性降低；静态顺应性结果显示该模拟肽可以显著提高经灌洗后的肺顺应性；分别构建了pEZ-rPA表达载体和pEZ-rPA-SPB融合蛋白表达载体，将pEZ-rPA-SPB成功转染到CHO-K1细胞中，并成功表达；融合蛋白上的SP-B成功在细胞膜上的定位并发挥功能；在LPS细胞损伤模型中，r-PA、r-PA/SP-B融合蛋白在细胞中的正常表达及功能没有受到明显影响，SP-B仍有膜结合能力；细胞拉曼光谱图分析显示：SP-B在细胞中可能通过其疏水性作用和膜结合能力，改变细胞膜上磷脂的构象，降低了磷脂分子的无序程度。