基于菌蜕传递系统的新型O157:H7 EHEC非活疫苗株的免疫保护效果及免疫作用机制

O157:H7 EHEC感染是一种新发的食源性传染病，能引起人的腹泻、出血性肠炎和致死性的溶血性尿毒综合征。受污染家畜及食物是该病的主要传染源，普遍存在毒素与活菌的共同感染。新型疫苗研究策略应是以预防人的原发感染和防止毒素引起的严重并发症为重要目标。因此，本研究拟在前期天然菌蜕构建的基础上，为了增加疫苗的保护力并扩大其保护范围，通过基因融合和重组技术，将已鉴定的Stx2、Stx1、Intimin等非膜保护性抗原与O157:H7外膜蛋白载体相融合，利用外膜展示系统将膜蛋白及非膜抗原蛋白共同呈现于细菌表面，构建新的嵌合型O157:H7 EHEC非活疫苗株。应用小鼠感染模型观察其免疫保护效果，评价其作为疫苗应用的可行性；并同时在分子和细胞水平对机体产生的体液及细胞免疫应答进行监测和分析，探讨嵌合型O157:H7 EHEC非活疫苗株的免疫作用机制。

自1982年在美国首次被确认为人类致病菌以来，肠出血性大肠杆(enterohemorrhagic E. coli，EHEC)已成为世界公共卫生问题，控制该病暴发流行的最好措施是疫苗免疫，目的是预防人的原发感染和在已感染患者中防止严重并发症的出现。本项目针对E.coli O157:H7感染致病的两个关键要素---黏附定植和毒性损伤，设计并评价了一种新型的候选疫苗分子，为E.coli O157:H7的感染防治研究提供了新思路、新方法。本研究利用志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae) OmpA的 N端233个氨基酸与大肠杆菌(E.coli) OmpA的 C端234-325位氨基酸构建了革兰氏阴性菌通用型夹心(sandwich)外膜展示载体sOmpA。应用此展示载体成功将SAmB分子在O157:H7菌蜕外膜上锚定表达。以菌蜕为传递系统，原有E.coli O157:H7细菌膜表面抗原与新的展示抗原一起提呈给免疫细胞，在小鼠上除了能诱导机体产生抗菌蜕特异抗体外，还诱导了抗Stxs (Stx1/Stx2)的特异抗体。同时，免疫血清抗intimin特异抗体的效价也获得了显著促升。相比原O157:H7菌蜕(12%)，类毒素表达的O157:H7嵌合菌蜕能更有效地保护小鼠抵抗高致死剂量(500 LD50) E.coli O157:H7活菌的灌胃攻击(52%)。同时，O157:H7嵌合菌蜕免疫能针对致死剂量E.coli O157:H7裂解菌的腹腔攻击提供原菌蜕免疫(2 LD50: 1/15；5 LD50: 0/15)所不具备的保护效果(2 LD50: 11/15；5 LD50: 3/15)。体外中和实验结果也验证，O157:H7嵌合菌蜕免疫血清具有一定的毒素中和效应。病理结果揭示，腹腔裂解菌攻毒的主要致死作用在于毒素效应(肾损伤)，而更接近于正常感染途径的灌胃攻毒除了肾损伤外，还产生了严重的肠道损伤(黏附擦拭损伤)。因此，采用类毒素抗原表达的O157:H7嵌合菌蜕免疫策略既能使机体产生抗病原菌黏附效应，又能及时中和病原菌释放出的毒素，有助于针对E.coli O157:H7感染实现更全面、有效的免疫保护。此外，本研究中构建的通用型夹心外膜展示载体sOmpA，也可应用于其它保护性抗原的携带和细菌表面呈现，以发展不同效用的新型递送型疫苗。