离子液体中果糖基转移酶构象转变与受体反应选择性关系的研究

果糖基转移酶催化蔗糖生成果糖与酶的过渡态复合体，复合体与不同的受体分子结合进而生成果糖基化合物，该过程称为受体反应。前期研究发现，在离子液体介质中，果糖基转移酶表现出与水溶液不同的受体反应选择性，其本质为酶的构象受到介质体系的影响而发生了转变所致，这其中的科学规律值得探索。本课题以米曲霉果糖基转移酶为模式酶，运用微量热、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱和圆二色谱等技术手段研究在离子液体中酶的受体反应选择性、反应动力学特征、酶结构热力学变化和分子构象转变，揭示酶选择性和分子构象转变的主要影响因素，建立酶的反应动力学模型和分子构象改变的热力学模型，分析并预测不同性质离子液体中酶活性变化规律和分子构象转变规律，从而搭建酶选择性与构象改变之间的关系，建立调控酶活性的方法。本课题，从微观尺度深化酶在离子液体介质中底物选择性的科学认识，拓展了酶促反应介质对酶影响的科学规律，具有重要的科学意义。

果糖基转移酶催化蔗糖生成果糖与酶的过渡态复合体，复合体与不同的受体分子结合进而生成果糖基化合物，该过程称为受体反应。离子液体介质影响果糖基转移酶催化过程中的受体反应选择性，酶分子构象转变是受体反应选择性发生改变的重要原因。本课题利用分子生物学方法建立了一整套的果糖基转移酶AoFT在大肠杆菌和毕赤酵母中克隆、表达及纯化方法；运用HPLC和LC-MS研究了酶AoFT在19种不同属性的离子液体中催化受体反应选择性，离子液体[Dmim][PF6]被确定为最佳反应介质；利用微量热ITC研究酶AoFT催化反应过程中的热力学参数（结合常数、结合位点数、摩尔结和焓和摩尔结合嫡等），建立了酶AoFT分子构象变化的两点结合热力学模型；利用 Cleland 表示法和King-Altman 法推导酶AoFT乒乓反应机制的动力学方程，建立了酶的反应动力学模型，并通过实验数据验证了该模型的真实可信度；利用傅里叶变换红外光谱和圆二色谱测定酶AoFT分子构象的变化，发现了离子液体中酶AoFT的α-螺旋含量与酶催化活性与受体反应选择性紧密相关。分析并建立了[Dmim][PF6]-磷酸缓冲液（20:80，v/v）中酶AoFT调控受体选择性方法，在反应条件如下：反应时间8 h、反应温度55、酶AoFT浓度为20 mg/mL、蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯摩尔比4 :1，蔗糖浓度为10 mg/mL，蔗糖-6-乙酸酯的产率提高到3.18倍以上。