赖氨酸氧化酶样蛋白2及其新剪切亚型在食管癌中的功能与作用机制

我们的前期实验结果表明，赖氨酸氧化酶样蛋白2（LOXL2）在食管癌中显著异常过表达，与癌细胞的浸润程度显著相关，可能是一个重要的新食管癌相关基因。最近，我们进一步发现了LOXL2的一个新剪切亚型，LOXL2Δ72。预实验结果提示，LOXL2Δ72在食管癌中同样过表达，但功能不清楚。基于此，本项目拟首先扩大标本量，明确LOXL2Δ72在食管癌中的过表达特征；然后通过基因表达敲降与基因高表达策略，控制LOXL2和/或LOXL2Δ72在食管癌细胞中的特异性表达，建立细胞模型，全面系统对比研究LOXL2和LOXL2Δ72在食管癌细胞中功能的异同及其相互关系；最后通过联合运用免疫共沉淀和蛋白质谱等实验方法，鉴定出与LOXL2和/或LOXL2Δ72的相互作用蛋白，在此基础上，结合相关细胞信号转导通路研究，把LOXL2/LOXL2Δ72在食管癌中的分子作用机制研究引向深入。

首先，我们研究发现，1）LOX家族在ESCC中表达上调，且LOXL2 mRNA的水平与ESCC淋巴结转移相关；同时，LOXL2的蛋白表达水平与ESCC的淋巴结转移以及患者术后生存率密切相关，LOXL2可以作为评判ESCC不良预后的独立指标；2）LOXL2可能在ESCC的胞核和胞浆中行使不同的功能；3）发现在食管癌组织细胞中，确实有LOXL2Δ72变异体存在，并且有过表达趋势； 4）构建了带Flag等标签LOXL2Δ72表达质粒，证实在各种细胞系中可表达LOXL2Δ72蛋白；5）研究发现，LOXL2Δ72蛋白主要分布在胞浆，与野生型LOXL2相比丧失了分泌能力；6）研究发现，与野生型LOXL2相比，LOXL2Δ72的氨氧化酶活性大幅度降低，只有野生型的10%左右。.其次，我们在成功建立LOXL2和LOXL2Δ72高表达的食管癌细胞模型的基础之上，在分子和细胞层面研究确定，LOXL2和LOXL2Δ72二者均具有促进食管癌细胞侵袭和迁移的能力，但相比较而言，后者的能力更强。.再次，为了进一步揭示LOXL2Δ72促食管癌细胞侵袭迁移分子作用机制，我们对LOXL2和LOXL2Δ72过表达的食管癌细胞系进行基因表达谱分析，结果发现，1）与对照组相比，LOXL2和LOXL2Δ72过表达可分别导致1234和719个基因发生显著异常表达；2）与LOXL2相比，LOXL2Δ72过表达导致198个基因发生显著异常表达，包括细胞侵袭迁移相关基因20个；3）利用real-time RT-PCR，我们确证CCL4、EREG和DOCK7等基因的表达可特异性地被LOXL2Δ72诱导上调，暗示LOXL2Δ72在促进食管癌细胞侵袭迁移过程中有着与LOXL2不同的分子机制。.最后，我们还发现了LOXL2的另一个全新的剪切亚型LOXL2Δe13，为LOXL2的第13外显子被完全切除。酶活性检测发现，LOXL2Δe13的酶活性比野生型的低，但具有比野生型更强的促进食管癌细胞侵袭迁移的能力。这些新的发现暗示着LOXL2基因本身在食管癌中表达调控的分子机制十分复杂，可能有更重要的科学问题孕育其中，有关情况正在继续深入探讨中，相应实验结果会在81000900项目结题后的年报材料中呈现。.迄今，81071737项目已发表SCI论文1篇，已投稿SCI论文3篇，培养中青年学术带头人2人，博士研究生1人，硕士研究生1人。