糖尿病视网膜病变AGE-修饰蛋白的差异蛋白质组学研究

Glycation is a kind of important post-translational modification of proteins, and abnormal glycation often lead to emergence and development of the human diseases. The rat models of early diabetic retinopathy (DR) will be established by streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats in the current study. AGE-modified proteins in serum and retinas of early DR rats are seperated by proteomic technology, such as 1-dimensional gel electrophoresis (1-DE), 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE), and western blot. The differential expressions of AGE-modified proteins in serum and retinas of early DR rats will be analyzed and compared by quantity-one and progenesis samespots. AGE-modified proteins in serum and retinas are identified by Matrix-Assisted Laser Desorption/Lonization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS). N-terminal glycation sites in AGE-modified proteins are predicted through NetNGlyc software, and the effect of glycation on the structures and functions of proteins are explored. In addition, the changes in microvessel morphology, ultrastructure in retinal tissues, and AGE-modified proteins glycation in rat serun and retinas will be observed after four weeks of intensive insulin therapy. The aim of this study is to reveal the influence of non-enzymed glycation of proteins on development of DR patients, and find new biomarkers for the diagnosis and treatment of early DR.

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，异常的糖基化常会导致人类疾病的发生发展。本项目通过链脲佐菌素诱导建立糖尿病早期视网膜病变（DR）大鼠模型；1-DE、2-DE和Western Blot分离大鼠血清和视网膜组织中的糖基化终末产物（AGE）-修饰蛋白；Quantity-one、Progenesis Samespots分析早期DR大鼠血清和视网膜组织中差异表达的AGE-修饰蛋白；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定被AGE修饰的蛋白质；NetNGlyc预测AGE-修饰蛋白N-端的糖基化位点，分析糖基化对蛋白质的结构和功能所产生的影响。另外，胰岛素强化治疗早期DR大鼠4周，观察大鼠视网膜组织微血管的形态、超微结构、血清和视网膜组织中AGE-修饰蛋白糖基化程度的改变。本研究将全面揭示蛋白质的非酶糖基化在DR患者发病中的作用，为DR患者的早期诊断和治疗找到新的生物标志物。

糖基化是蛋白质翻译后重要的修饰方式之一，对细胞的正常生长起着重要的调节作用，直接或间接地影响着蛋白质的生物学功能。蛋白质的异常糖基化常会导致人类疾病的发生发展，如糖尿病(DM)、衰老和神经元退行性病变等。高血糖情况下蛋白质的非酶糖基化增加，所形成的AGE-修饰蛋白在组织中的靶向聚集，与DM终末器官的损害，特别是与糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病肾病和糖尿病周围神经病变等微血管病变的发生发展密切相关。. 本研究中选择成年雄性SD 大鼠90只，随机分为正常对照组（n=30）和DM 组（n=60）。DM 组按60ｍg/kg 腹腔注射1%STZ１次，正常对照组则注射等量枸橼酸钠-枸橼酸三钠缓冲液。连续3 天测定随机血糖，DM 组大鼠若血≥16mmol/L，即算造膜成功。成模后，DM 大鼠再分为：DM 病程1 月组（n=30）、DM 病程3 月组（n=30）。2 组分别在成膜后1 个月、3 个月处死大鼠，迅速取出眼球，在解剖显微镜下分离视网膜组织，进行HE 染色、透射电镜超微结构观察。其它视网膜组织液氮速冻，提取总蛋白，-80 ℃保存。结果显示光镜下随着随着DM病程的增加，DM大鼠毛细血管染色不均，官腔闭塞，基底膜增厚。电镜下随着DM病程增加，毛细血管内皮细胞肿胀，视网膜微绒毛增多，毛细血管基底膜增厚。ELIS定量分析显示DM大鼠血清和视网膜组织中AGE-修饰蛋白的浓度显著高于正常对照组。1-DE/Western blot分离3组大鼠血清和视网膜组织中的AGE-修饰蛋白，2-DE/Western blot分离3组大鼠血清和视网膜组织中的AGE-修饰蛋白，以Quantity-one和Progenesis Samespots软件分析早期大鼠血清和视网膜组织中AGE-修饰蛋白的表达，目前表达分析和蛋白鉴定正在进一步分析当中。