与包涵体形成相关的GCRV非结构蛋白NS80的功能域研究

在呼肠孤病毒侵染宿主细胞的过程中，通常在细胞质内形成一种致密的病毒包涵体结构，病毒基因组转录复制及子代病毒的包装在其内进行。基于GCRV基因组同源序列分析，推测其非结构蛋白NS80与该包涵体结构的形成密切相关。为探讨GCRV非结构蛋白 NS80在病毒复制中形成包涵体的分子机理，本项目拟构建NS80全长表达、N端与C缺失表达、GFP融合表达及另一种非结构蛋白NS38表达载体，将其构建体分别或共转染哺乳动物细胞，获得重组蛋白的瞬时表达。采用免疫印迹、免疫荧光或免疫共沉淀等技术，分析NS80及其截短蛋白在转染细胞中的表达及包涵体形成状况。此外，通过分析NS38的单独表达以及NS38/NS80蛋白的共表达，了解在包涵体形成中NS80与NS38的关联性,由此定位与包涵体形成相关的NS80功能结构域。该研究将为揭示NS80在病毒复制中的包涵体形成与包装过程中与其它蛋白的相互作用机制提供依据。

呼肠孤病毒科成员具有在病毒感染细胞中形成典型的病毒加工厂（或称为包涵体）样的特化结构。序列同源性分析表明，草鱼呼肠孤病毒 (Grass Carp Reovirus，GCRV) 非结构蛋白NS80与包涵体结构形成相关。本研究在对包涵体形成的相关蛋白NS80特性研究基础上，利用免疫荧光方法，在病毒感染的不同时间观察细胞内包涵体的形态变化，发现在病毒感染细胞后，随着时间的推移，病毒包涵体不断变大，并有向核周移动的趋势。此外，转染实验表明，单独表达的NS80蛋白就可以在转染细胞中形成与病毒感染细胞中类似的包涵体结构，而单独表达的非结构蛋白NS38或结构蛋白VP4都不能形成包涵体结构。共转染和免疫共沉淀实验发现NS80可以招募NS38和VP4至包涵体结构中。为了研究包涵体的形成与细胞骨架微管蛋白之间的关系，使用微管抑制剂Nocodazole处理细胞，使微管解聚，结果发现无论是在病毒感染还是NS80转染的细胞中，包涵体的形态和分布都不受影响，表明包涵体的形成不依赖于细胞的微管骨架系统。为了进一步精确定位NS80与包涵体形成相关的结构域，构建了一系列NS80C及N末端缺失体及进行了转染实验，结果发现，NS80C端4个氨基酸的缺失及突变Coiled-coil结构就会导致包涵体形成能力的丧失；并确定了530-742氨基酸区域为包涵体形成的最小区域。值得指出的是，随着N端的缺失，在NS80 471 to 513-742区域可形成核包涵体，并检测到核包涵体与细胞蛋白β-catenin共定位。结果表明，Aquareovirus NS80具有形成包涵体功能，并能招募结构蛋白VP4及非结构蛋白NS38到其包涵体结构中，其NS80 coiled-coil结构区域及C末端结构对病毒包涵体的形成至关重要。