Akt信号通路及其相关microRNA在NGF调控角膜上皮细胞增殖中的作用机制研究

神经源性角膜炎是由多种原因引起角膜神经损伤造成角膜上皮退行性变的疾病，它的预后差、治疗棘手。临床研究表明神经生长因子（NGF）对该病具有良好的疗效，但其确切的作用机理仍未明确。我们在前期工作中发现与对照组相比，NGF处理角膜上皮细胞后Akt信号通路及其相关的miRNA均出现了独特的异常表达；借助已知的miRNA-靶基因网络，我们进一步发现cyclin D家族基因是一个潜在的关键作用位点。本项目拟在此基础上研究NGF处理角膜上皮细胞后Akt信号通路及相关miRNA的表达规律；明确与Akt信号通路相互作用的miRNA种类；探讨miRNA候选靶基因cyclin D的表达情况，明确角膜上皮细胞增殖能力的变化规律。通过上述实验，可望为NGF治疗神经源性角膜炎提供更为充分的实验依据，并为明确NGF在角膜上皮自我更新中的作用提供新的视角。

神经源性角膜炎是以角膜上皮细胞进行性坏死、脱落为特征的眼表疾病，其愈后差，治疗棘手。给予患者外源性神经生长因子(NGF)治疗，可有效阻止病程发展，修复角膜上皮损伤，但其作用机制尚不明确。研究中我们发现在体外培养条件下，25ng/ml NGF处理角膜上皮细胞（HCEC）1小时，能激活HCEC 中PI3K/Akt和MAPK/Erk信号通路，我们运用Agilent human miRNA芯片和qRT-PCR技术，分析NGF处理后HCEC中miRNA的表达差异，发现处理后miRNA-494降低为对照组的54%，是表达差异最大的miRNA。进一步构建过表达miRNA-494的慢病毒载体pGIPZ-GFP-miR-494，并转入永生化人角膜上皮细胞系（iHCEC）。NGF处理转染pGIPZ-GFP-miR-494及空质粒（pGIPZ-GFP-miR-NC）的iHCEC 1小时，流式细胞仪检测细胞周期，发现转染pGIPZ-GFP-miR-494后，G1期细胞增多，S期细胞减少，细胞周期阻滞于G1期，延缓细胞周期进展。NGF可逆转miRNA-494对细胞周期的抑制作用，推动细胞周期中G1期向S期转变，加快细胞周期，促进角膜上皮细胞增殖。本研究对miRNA-494的靶基因进行进一步研究，探讨其抑制HCEC细胞周期的机制。我们应用多种生物信息学软件预测得到miRNA-494的靶基因集，挑选参与细胞周期的基因——cyclin D1，并用双荧光素酶报告基因系统对其验证。我们将cyclin D1 3'-UTR 区域克隆到pmir-GLO载体中，与含有miRNA-494成熟序列的载体一同转入293T细胞，检测各组荧光素酶报告基因的活性，发现含cyclin D1野生型序列的荧光素酶活性明显低于对照组(P<0.05)，说明cyclin D1是miRNA-494的一个靶基因。最后，我们用qRT-PCR及Western Blot技术验证miRNA-494对cyclin D1 mRNA和蛋白表达的影响。证实过表达miRNA-494的细胞中，cyclin D1 mRNA和蛋白表达下调。NGF可以下调miRNA-494的表达，逆转其对cyclin D1的抑制作用，从而上调cyclin D1基因，加速细胞周期，促进HCEC增殖。这是NGF治疗神经源性角膜炎的分子机制之一，为治疗神经源性角膜炎提供新的治疗靶点。