磷酸化组氨酸（pHis）的抗体富集、质谱鉴定及生物功能研究

We will focus on ‘chemical labeling and detection technology of dynamic modification of biological macromolecule’. It has been made limited progresses on histidine phosphorylation study because of thermal instability and acid instability of histidine phosphorylation. Based on IMAC enrichment, mass spectrometry can identify 246 histidine phosphorylation sites, and there is no report about enrichment of phospho-histidine with monoclonal antibody. High abundant phosphorylation, such as serine phosphorylation and threonine phosphorylation will compete with histidine phosphorylation, this will perturb enrichment of phosphor-histidine. We will use phospho-histidine monoclonal antibody to purify histidine phosphorylated peptides, and combine with mass spectrometry to identify these peptides. Proteasome subunits have higher histidine phosphorylation level, but the phosphorylation site is unknown. We will apply our enrichment and identification approach to map histidine phosphorylation sites of proteasome, and investigate its function in liver cancer. At the same time, we will synthesize histidine targeted cross-linkable unnatural amino acid and screen tRNA synthetease for this unnatural amino acid. It will be used to characterize regulation of histidine phosphorylation enzyme, histidine phosphorylation sites and proteasome activity.

本课题紧密围绕“生物大分子动态修饰的化学标记与检测技术”展开。组氨酸磷酸化的热不稳定性和酸不稳定性，使得它的相关研究一直进展缓慢。目前使用质谱和IMAC技术最多可以鉴定到246个组氨酸磷酸化位点。还没有使用抗体在肽段水平富集组氨酸磷酸化的报道。使用IMAC技术纯化组氨酸磷酸化会受到其它高丰度磷酸化形式的竞争，最终影响组氨酸磷酸化富集的效果。我们将开发基于组氨酸磷酸化抗体的肽段富集技术，通过生物质谱规模化鉴定蛋白质的组氨酸磷酸化修饰位点。根据已有报道，26S蛋白酶体的组氨酸磷酸化水平较高，但是具体位点并不清楚。我们将全面鉴定蛋白质酶体中的组氨酸磷酸化修饰位点，并探究其在肝癌发生发展中的作用。同时我们将开发仅与组氨酸反应的非天然氨基酸，并筛选识别该非天然氨基酸氨酰-tRNA合成酶。通过非天然氨基酸研究组氨酸磷酸化激酶、磷酸酶，组氨酸磷酸化修饰位点与蛋白酶体活性三者之间的关系。

组氨酸磷酸化离体后不稳定极易降解，生物质谱是目前鉴定蛋白质组氨酸磷酸化的最有效手段，但是质谱样品的制备过程以及质谱分析条件容易导致组氨酸磷酸化修饰的丢失。由于上述原因，使得组氨酸磷酸化位点的鉴定成为一个巨大的挑战。在本项目中，我们通过制备组氨酸磷酸化抗体来富集组氨酸磷酸化修饰肽段，提高组氨酸磷酸化修饰肽段的鉴定的灵敏度。同时优化样品制备和质谱分析的条件，最大可能的减少组氨酸磷酸化修饰的损失。最终实现了在哺乳动物细胞中规模化鉴定组氨酸磷酸化修饰。. 我们使用交联非天然氨基酸研究组氨酸磷酸化相关酶与底物的相互作用，通过交联非天然氨基酸捕获酶与底物弱的，瞬时的蛋白质相互作用，最终通过生物质谱鉴定这种直接的蛋白质相互作用。为了全面解析交联非天然氨基酸相关的质谱数据，我们开发了非天然氨基酸交联质谱鉴定软件OpenUaa，利用该软件和新开发的交联肽段富集方法，我们大规模鉴定了硫氧还原蛋白的直接相互作用蛋白。利用OpenUaa软件进行进一步的数据挖掘，我们发现了交联非天然氨基酸BprY新的反应活性，其中包括与组氨酸反应的活性，利用BprY我们鉴定了SUMO2的直接相互作用蛋白质组。为了能够在活细胞中研究组氨酸磷酸化相关酶与底物之间直接的相互作用，我们建立了哺乳动物细胞中蛋白酶与底物的交联方法，开发了一系列基于活性的底物探针，这些探针能够有效的在活细胞中捕获活化的蛋白质酶，并且可以用来筛选相关蛋白酶的抑制剂。针对组氨酸磷酸化相关酶与底物，我们开发了新型的能够与组氨酸交联的非天然氨基酸EY1，并且筛选到了能够识别这种非天然氨基酸的氨酰-tRNA合酶，证实了EY1与组氨酸的交联反应活性。利用交联技术我们鉴定到了与组氨酸磷酸酶，组氨酸激酶直接相互作用的蛋白质，并且验证了这些蛋白质相互作用。