基于适配体等多重链替代扩增-毛细管电泳高通量检测低丰度蛋白质新技术

The amount of cancer-associated proteins are very low in the early diagnosis. Moreover, the proteins have a good variety in the complicated biological sample matrix. And then the analysis of the low abundance proteins is one of the most challenging analytical problems. The low abundance cancer-associated proteins such as PDGF-BB, VEGF, thrombin, γ-interferon, folate receptor and streptavidin were chosen as study subjects. The molecular probes based on aptamer and small molecule for specific binding protein were designed for different proteins in this project. Upon the target proteins, huge amounts of reporter DNA were produced by multiplex strand displacement amplification. As a result, the proteins was determined by detecting the reporter oligonucleotides. Moreover, the experimental parameters such as the structure of probes as well as tempreature and time for reaction need to be optimized carefully in order to obtain the best amplication efficiency. And then capillary electrophoresis (CE) was developed to analyze different nucleic acids produced by amplification. The research of this project will be of great significance in improving the detection sensitivity and achieving the highly sensitive and high throughput detection of low abundance cancer-associated proteins in clinical sample. It will be helpful in the early diagnosis, curative effect monitoring and successful treatment for disease, as well as the discovery of new drug therapy target.

在癌症早期诊断中，样品基体复杂，蛋白质种类繁多，而且与癌症相关的蛋白质含量非常低，因此生物样品中低丰度蛋白质特别是与癌症相关的低丰度蛋白质的检测仍然是最具挑战性的难题之一。本课题拟以血小板衍生因子（PDGF-BB）、血管内皮增长因子(VEGF)、凝血酶、叶酸受体、γ-干扰素、链霉亲和素等与癌症相关的低丰度蛋白质为研究对象。利用适配体等能与其特异结合的小分子，设计合成对其具有特异性响应的核酸分子探针，借助多重链替代扩增技术将低丰度蛋白质定量扩增转化为寡核苷酸，通过对影响扩增效率的主要因素进行考察和优化，使扩增效率达到最大。然后利用毛细管电泳对扩增产物进行分离测定，实现临床样品中与癌症相关的低丰度蛋白的高通量、高灵敏检测。开展此课题研究不仅可显著提高低丰度蛋白质的检测方法的灵敏度，而且可为临床样本检测和疾病筛查提供新的技术，对癌症早期诊断、治疗，以及新药物治疗标靶的发现等具有重要意义。

在癌症早期诊断中，样品基体复杂，蛋白质种类繁多，而且与癌症相关的蛋白质含量非常低，因此生物样品中低丰度蛋白质,特别是与癌症相关的低丰度蛋白质的检测仍然是最具挑战性的难题之一。本课题以癌症相关低丰度蛋白-血小板衍生因子（PDGF-BB）为研究对象，设计合成基于适配体的、对目标蛋白具有特异性响应的核酸分子探针，借助链替代扩增技术将低丰度蛋白定量扩增转化为寡核苷酸，通过核酸标记的金纳米检测扩增产物，实现对血小板衍生因子的可视化检测,检测的线性范围：2.0-80 nM，检测限高达1.1 nM；以癌症相关蛋白血管内皮增长因子(VEGF165)为研究对象，利用核酸适配体等能与其特异结合的特性，设计合成了对其具有特异响应的发夹结构核酸分子探针，借助链替代扩增技术和指数扩增技术将低丰度蛋白质定量扩增转化为具有G-四连体结构的DNA，实现对VEGF165的无标记、可视化检测, 线性范围：24.00 pM-11.25 nM，检测限高达1.7 pM；基于酶修复反应调制的链替代扩增和指数扩增反应建立了检测DNA甲基转移酶（DAM）的荧光分析方法，检测灵敏限高达0.007 U/mL；利用 WS2 纳米片和两种荧光基团标记的 DNA 探针建立了一种新型的双色荧光传感平台用于 Hg2+和 Ag+的检测。不使用任何掩蔽剂，该方法能够实现复杂体系中 Hg2+和 Ag+的同时测定，具有较高的灵敏度和特异性，检测限分别为3.3和1.2 nM；首次利用 WS2 纳米片与多肽序列之间的相互作用，建立了新型荧光传感平台用于 β-分泌酶（BACE1)的活性检测及其抑制剂的初步筛选，检测限高达66 pM。. 本项目的开展和研究为复杂样品中低丰度蛋白质的分析检测提供了简单、高灵敏、高特异性的分析方法。各种扩增方法的成功应用，可解决毛细管电泳分离能力强，但检测灵敏度低的问题，为毛细管电泳高通量检测低含量组分奠定了坚实的基础。