马克斯克鲁维酵母GX-UN120乙醇脱氢酶基因的功能研究

Kluyveromyces marxianus has been reported to grow at 45°С and even 52°С and to produce ethanol at temperatures above 40°C. But there are a few scientific papers on the ADH systems which are key enzymes in ethanol metabolism of K. marxianus. The K. marxianus GX-UN120 is a mutant strain from GX-15 which was obtained in our laboratory and an excellent ethanol producer at 40°C. The four ADH genes of K. marxianus GX-UN120 were cloned and expressed in E. coli. The characteristics of these four ADHs were researched. This project will constructed the disrupted mutants of these four ADH genes of GX-UN120 and their complementary strains. The phenotypes and fermentation characteristics of the disrupted mutants and their complementary strains will be analyzed to speculate the physiological functions of the four ADH genes in GX-UN120.

马克斯克鲁维酵母能在高达52ºC下生长且能在40ºC下产乙醇，但有关该酵母控制乙醇代谢的关键酶乙醇脱氢酶（ADH）的研究很少。本课题组前期分离得到1株能在40ºC发酵乙醇的优良菌株马克斯克鲁维酵母GX-15，对GX-15进行经紫外线-亚硝基胍复合诱变后得到1株发酵性能更好的遗传性能稳定的突变菌株GX-UN120。已克隆了该菌株的4个乙醇脱氢酶基因并在E. coli中表达，对这四个乙醇脱氢酶（ADH1、ADH2、ADH3和ADH4）的酶学特性进行了详细研究。在此基础上，本项目拟通过构建这四个基因的缺失突变体及其互补菌株来研究这四个基因在GX-UN120中的功能，以揭示GX-UN120的乙醇脱氢酶系在调控乙醇发酵中的作用。

本研究成功地构建了GX-UN120 的KmADH1、KmADH2、KmADH3和KmADH4基因的缺失突变体及KmADH2和KmADH3基因的缺失突变体的回补菌株。对比亲本菌株GX-UN120分析了各个缺失突变菌株及回补菌株的乙醇脱氢酶同工酶谱、利用各种碳源的能力、耐高温性能及发酵葡萄糖产乙醇情况。从研究结果可以初步推测，在GX-UN120菌株发酵葡萄糖产乙醇过程中，KmADH 1和KmADH 4大量表达，KmADH2和KmADH3不表达或表达量很少。当编码KmADH1的KmADH1基因缺失后，由于没有KmADH1表达，菌株于是启动KmADH2基因的表达。KmADH1基因和KmADH4基因缺失后利用各种碳源、耐高温生长及产乙醇的能力与均GX-UN120菌株没有明显的差异；KmADH2基因缺失后利用各种碳源的能力有所下降、乙醇产量显著降低，但耐高温生长性能没有改变；KmADH3基因缺失后利用各种碳源和耐高温生长性能没有明显变化，但是乙醇产量有较明显的降低。.这些结果表明KmADH1是GX-UN120菌株产乙醇的关键酶，但不是必需的酶，一般情况下由KmADH1催化将乙醛转化为乙醇，而缺失KmADH1基因的菌株启动KmADH2基因的表达，继而通过KmADH2行使催化乙醇形成的功能。KmADH2在乙醇发酵中起重要作用，KmADH2基因的缺失使用乙醇产量下降了75%。.本项目首次系统研究了马克斯克鲁维酵母乙醇脱氢酶在发酵葡萄糖产乙醇中的综合作用，明确了在发酵葡萄糖产乙醇过程中KmADH1基因和KmADH2基因的协同作用，这个结果将为进一步深入研究马克斯克鲁维酵母的乙醇代谢调控及通过改造KmADH1基因和KmADH2基因来提高马克斯克鲁维酵母产乙醇能力提供了重要的理论基础。