蚕丝中Seroin蛋白的抗菌机制研究

The silk constructs cocoon by fiber proteins (fibroins) and adhesive glue proteins (sericins), which provide a physical barrier to protect the inside silkworm pupa. Moreover, many antimicrobial proteins were also found in the cocoon silk. Seroin proteins are not only the antimicrobial proteins with highest abundance in the cocoon silk, but also show high antimicrobial activity. In order to reveal the antibacterial mechanism of Seroin proteins, this project will express the Seroin1 and Seroin2 of silkworm in prokaryotic and eukaryotic expression system, and reveal their key motifs and amino acid residues by crystal structure analysis and site-directed mutagenesis. In order to clarify the antibacterial mechanism of Seroins, this project will also incubate the Seroins with gram negative Escherichia coli and gram positive Micrococcus luteus, and then detect the changes of the two types of bacteria in cell wall, membrane, DNA and protein. This project will greatly increase our knowledge about the antimicrobial functions of the silk, and will help develop competitive and high-value antimicrobial silk products.

蚕茧主要由纤维性的丝素蛋白和黏性的丝胶蛋白构成，它们通过提供物理屏障来保护内在的蚕蛹。本项目的前期研究发现蚕丝中还存在多种类型的抗菌蛋白来保护蚕蛹。其中，Seroin蛋白不仅是蚕丝中含量最高的抗菌蛋白，还具有很高的抗菌活性。为了揭示蚕丝中Seroin蛋白的抗菌机制，本项目拟通过原核表达和真核表达的方法获得家蚕的Seroin1和Seroin2蛋白，在对Seroin蛋白进行结构解析和基因定点突变的基础上揭示Seroin蛋白发挥抗菌活性的关键区域和位点。本项目还将通过研究Seroin蛋白与革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌藤黄微球菌孵育后所导致的两种细菌的细胞壁、膜、DNA及蛋白质分子的变化，进一步阐明Seroin蛋白的抗菌作用机制。本项目的顺利实施将大大提高人们对蚕丝抗菌功能的认识，有助于开发有市场竞争力的和高附加值的抗菌蚕丝制品。

蚕丝主要由纤维性的丝素蛋白和黏性的丝胶蛋白构成，它们通过提供物理屏障来保护内在的蚕蛹。本项目的前期研究发现蚕丝中还存在多种抗菌蛋白来保护蚕蛹，其中蚕丝中的蛋白酶抑制剂能够抑制真菌的生长，而蚕丝中的丝蕊蛋白（Seroin）能够抑制细菌的生长。为了阐释蚕丝中丝蕊蛋白的抗菌机制，本项目首先调查了3种家蚕丝蕊蛋白的表达模式，发现丝蕊蛋白1和丝蕊蛋白2主要在家蚕的丝腺中表达而分泌到蚕丝中，而丝蕊蛋白3主要在家蚕的卵巢中特异表达而分泌到蚕卵中。通过用两种细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）和两种真菌（酵母和白色念珠菌）分别感染家蚕，发现丝蕊蛋白1、2、3在细菌或真菌诱导后的多个时间点显著上调表达，其中丝蕊蛋白2受诱导上调表达的倍数最高。我们通过多肽合成的方法获得了家蚕的丝蕊蛋白1、2、3，发现丝蕊蛋白2的抗菌活性比丝蕊蛋白1和3更高，丝蕊蛋白2对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）的抗菌活性比对大肠杆菌和两种真菌的抗菌活性更高。在对丝蕊蛋白进行序列与结构分析的基础上，我们将三个丝蕊蛋白分别截断为了两个结构域，合成后发现三种丝蕊蛋白的N端比C端具有更高的抗菌活性，丝蕊蛋白2的N端比丝蕊蛋白1和3的N端抗菌活性更高。进一步的研究发现丝蕊蛋白的C端具有很强的结合细菌细胞壁中肽聚糖的活性，用肽聚糖封闭丝蕊蛋白2的糖结合位点后，丝蕊蛋白2的抗菌活性被显著抑制。总之，我们发现丝蕊蛋白1和2在蚕茧中发挥抗菌作用，而丝蕊蛋白3在蚕卵中发挥抗菌功能；三种丝蕊蛋白具有相同的抗菌机制，即通过C端结合细菌细胞壁中的多糖模式识别分子，通过N端抑制细菌的生长。本项目的研究成果大大地提高我们对丝蕊蛋白的抗菌活性及抗菌机制的认识，有助于开发有市场竞争力的和高附加值的抗菌蚕丝产品和药物。