非热等离子体ROS效应诱导S. aureus形成VBNC状态的分子机制研究

The viable but nonculturable (VBNC) bacteria cannot be detected by conventional cultivation methods, but it may be able to recover under optimal conditions. Therefore, the bacteria in VBNC state are considered as “recessive pollutant source” which have potential risk to public health. As a novel nonthermal sterilization technique, nonthermal plasma (NTP) is able to guarantee the bactericidal efficacy and maintain the food quality and nutrition. Our previous study found that the reactive oxygen species (ROS) produced by NTP could induce S. aureus to enter into the VBNC state, while the induction mechanisms are still not clear. In this project, the biological characteristics and molecular regulation mechanisms of VBNC S. aureus cells induced by NTP-ROS will be investigated by comprehensive transcriptomics, proteomics, and bioinformatics methods. The mutants of S. aureus will be constructed to verify the functions of differentially expressed genes and proteins in order to further identify the key regulatory factors. The achievements from this project will provide valuable theoretical basis to inhibiting the formation of VBNC S. aureus cells during the NTP processing, and also help optimize NTP sterilizing technology to guarantee food safety.

细菌处于活的不可培养（VBNC）状态时无法用常规培养方法检出，但却具有在适宜条件下复苏的能力，因此被认为是威胁食品安全的“隐性污染源”。作为新兴非热杀菌技术，非热等离子体（NTP）在保障杀菌效果的同时，可有效维持食品的品质和营养。申请人前期研究发现，NTP激发产生的ROS可诱导S. aureus形成VBNC状态，但其分子机制尚不明确。针对这一科学问题，本项目以S. aureus为研究对象，系统考察NTP-ROS效应诱导形成的VBNC状态S. aureus的生物学特性，综合运用转录组学、蛋白组学和生物信息学分析VBNC状态S. aureus的差异表达基因和蛋白，并通过构建突变体对差异基因和蛋白进行功能学验证，系统揭示NTP-ROS效应诱导S. aureus形成VBNC状态的分子机制，为进一步优化NTP杀菌工艺、保障NTP加工食品的安全性奠定理论基础。

本项目采用分子生物学、转录组学、蛋白组学和生物信息学等相结合的技术手段系统研究了NTP-ROS效应诱导S. aureus形成VBNC状态的分子机制，主要研究结果如下：（1）提出NTP对S. aureus的“多靶点”作用模式，在代谢特性方面，由NTP产生的ROS（如H2O2）可通过细胞膜进入胞内，干扰细菌正常的新陈代谢活动；在膜结构和功能方面，NTP-ROS效应诱作用于细菌细胞膜磷脂双分子层，破坏细胞膜/壁的完整性；（2）明确了NTP-ROS效应对VBNC状态 S. aureus的诱导情况，结果显示随着贮藏时间延长，S. aureus总活菌数没有显著变化，可培养状态菌数逐渐降低；且随着NTP所施加能量从 8.1 kJ 增加至 24.3 kJ 时，S. aureus完全进入VBNC 状态所需时间从 80 h 缩短至 16 h；（3）考察了VBNC状态 S. aureus的生物学特性，结果显示与可培养状态S. aureus相比，VBNC状态 S. aureus胞内ATP水平和pH显著降低，胞内类脂酶C14等7 种代谢酶的活性发生下降，但碱性磷酸酶等 5 种代谢酶的活性未发生变化。且VBNC状态 S. aureus细胞膜中反异构型支链脂肪酸含量显著增加，而饱和脂肪酸和长链脂肪酸（C18:0、C19:0、C20:0）比例发生显著下降，细胞膜的流动性趋向增强；（4）发现了NTP-ROS效应是导致S. aureus胞内ATP水平发生损耗的主要因素，进一步基于高通量转录组学（RNA-seq），解析了VBNC S. aureus代谢、基因信息和环境信息处理相关通路的调控情况，从而初步揭示NTP-ROS效应对 VBNC S. aureus的诱导机制：上述研究成果可为抑制NTP杀菌过程中细菌VBNC状态的形成奠定理论基础，进一步优化NTP杀菌工艺，保障NTP加工食品的安全性。