фC31整合酶介导外源基因在猪基因组内高效定点整合的分子基础研究

Efficient and site-specific exogenous gene integration is a barrier in pig genome modification. In order to address this problem, the following research will be conducted,based on the fact that фC31 integrase is capable of catalyzing site-specific recombination,as well as previous studies in our group:(1)to prove фC31 integrase has good catalyzing activity in pig cellular environment using intramolecular recombination;(2) using intermolecular recombination, to predict and isolate pig candidate pseudo attP site through pig somatic cell single colony,nested inverse PCR and MEME-based motif searching;(3) to obtain pig functional pseudo attP site by activity rescue through seamless gene cloning;(4) to clarify the active characteristics of pig functional pseudo attP site by studying recombination efficiency,exogenous gene structure,EGFP expression,insertion effect and genome-wide distribution. This study aims to discover the molecular basis of фC31 integrase-mediated efficient and site-specific exogenous gene integration within pig genome. The results will provide important scientific data for activity of фC31 integrase in pig cells, and provide novel strategy for targeted pig genome modification, and valuable gene locus with independent intellectual property rights.

外源基因的高效定点整合是猪基因组修饰研究的难点。为化解上述难题，本项目立足фC31整合酶催化位点特异重组的理论基础，结合前期工作积累，拟开展如下研究：(1)利用分子内重组反应，证实фC31整合酶在猪细胞环境具有良好催化活性；(2)利用分子间重组反应，通过体细胞单克隆化、反向巢式PCR、MEME软件搜索共有基序，预测和分离猪候选假attP位点；(3)运用本课题组建立的无缝基因克隆技术克隆候选位点,构建拯救载体，验证其重组活性，获得猪功能性假attP位点；(4)通过重组效率、外源基因结构、EGFP表达、位置效应、基因组分布特点等方面的考查，阐明该类位点的活性特征。本项目旨在揭示фC31整合酶介导外源基因在猪基因组内高效定点整合的分子基础。研究结果将提供该酶在猪细胞内发挥催化功能的重要实验依据，为猪基因组定点修饰提供新策略，并提供重要的自主知识产权基因座位。

运用各种分子手段将外源基因整合于猪基因组，赋予猪特定的性状，是推动猪用于基础科学、农业和医学研究的有效途径。但是长期以来，缺乏介导外源基因高效定点整合于猪基因组的有力工具。фC31整合酶来自链霉菌噬菌体，属于位点特异重组酶的丝氨酸家族，可催化两个不同的识别位点attB (细菌附着位点, bacterial attachment site)和attP (噬菌体附着位点, phage attachment site)之间的特异重组。作为原核生物附着位点的attB和attP，理论上在动物基因组内不会出现，但是研究发现фC31整合酶具有修饰未改造动物基因组(unmodified genome)的能力，这是因为动物基因组内存在与野生attP位点具有一定相似度的天然序列，被称为“假attP位点”(pseudo attP site)，可作为фC31整合酶的锚定位点，介导外源基因的定点整合。本项目的研究目标是探明фC31整合酶介导猪基因组定点修饰的分子基础。开展的主要研究内容包括：（1）фC31整合酶在猪细胞环境内的催化活性研究；（2）猪候选假attP位点的分离与预测；（3）猪功能性假attP位点的获得；（4）猪功能性假attP位点的活性特征分析。取得的重要结果与关键数据有：（1）在猪永生化细胞PK15内，фC31整合酶介导分子内位点特异重组的效率达到82%，其介导分子间重组的最佳摩尔比例是5:1。（2）通过稳定细胞系筛选、热不对称PCR，分离和鉴定了猪PK15 细胞内的4个假attP位点，分别位于猪的1、3、7和9号染色体的基因间隔区，与野生型attP位点的相似度分别为31%、18%、26%、23%。（3）跨界PCR显示，外源基因在这4个假attP位点的整合形式均为单拷贝、单等位基因。（4）通过活性拯救实验，证明这4个假attP位点均有重组活性，但是活性效能有差别，分别为60%、40%、30%、28%。（5）报告基因在这整合于这4个假attP位点的报告基因均有不同程度的表达，胞外EGFP相对丰度为15、2、3、7，胞内EGFP相对丰度为8、3、4、6。（6）细胞增殖实验证明在这4个假attP位点整合外源基因后，细胞的增值能力与野生型PK15细胞相比未发生变化。该项目的科学意义有：通过鉴定、验证猪基因组假attP位点，发现了4个支持外源基因高效表达的“友好位点”，这为将功能基因特异